第四军医大学学报1999年第20卷第9期

李德闽汪曾炜易定华

摘要目的：评价冷血心肌麻痹液(CBC)温度对心肌保护效果的影响.方法：离体鼠心经CBC不同温度（4，8，12，16和20℃）停搏120min及再灌注60min,测定心肌肌浆网（SR）Ca²⁺-ATPase活性、钙摄取和SRCa²⁺-ATPasemRNA表达的改变.结果：4，8，12℃组SRCa²⁺-ATPase活性、钙摄取保护优于16和20℃组（P＜0.01），4℃～16℃组SRCa²⁺-ATPasemRNA表达量为对照组1.18～1.32倍（P＞0.05），20℃组表达量为对照组的1.63倍（P＜0.05）.结论:温度影响CBC心肌保护效果，SRCa²⁺-ATPasemRNA表达上调可能与SR泵功能受损的特异修复机制有关.

关键词：心麻痹液温度肌浆网RNA,信使

0引言

为评估冷血心肌麻痹液(cold blood cardio plegia，CBC)温度对心肌保护效果的影响,我们以离体大鼠心脏灌注模型，对不同温度CBC停搏和再灌注后心肌肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)Ca²⁺-ATPase活性和钙摄取的改变进行了研究，并以斑点杂交(dot blot)观察了SRCa²⁺-ATPase mRNA表达的改变，探讨CBC温度与心肌保护效果的关系.

1材料和方法

1.1模型Langendorff离体鼠心灌注模型，灌注压9.81kPa.雄性SD大鼠(本校实验动物中心提供)，体质量250g～300g，随机按停搏心肌温度不同分为4，8，12，16和20℃5组(n=8).氧合血与晶体液按8∶1稀释配制CBC^［1］，HCT16%～18%,PaO₂33.33kPa～40.0kPa,pH7.6～7.8，K⁺18mmol/L～20mmol/L.动物以异戊巴比妥钠（60mg/kg）麻醉后静脉推注肝素500U，开胸将心脏取出立即浸泡于4℃生理盐水中，修剪后接Langendorff灌注37℃改良Krebs-Hensleit碳酸缓冲液（KHBB），10min后经主动脉根部灌注CBC诱停（20mL/kg），心脏浸于冷生理盐水中，由低温恒温器控制设定温度(±0.5℃)，经室间隔插入针式心肌测温仪持续监测心肌温度,每20min重复半量CBC灌注1次,停搏2h时以37℃的KHBB再灌注1h.心脏称重置液氮冻存.每组随机取2例左心室全层心肌，JEM-2000型透射电镜观察超微结构.对照组(n=6)将心脏取出后经Langedorff灌注37℃KHBB10min后置液氮冻存.

1.2方法

1.2.1SRCa²⁺-ATPase活性⁴⁵Ca²⁺摄取测定低温超速离心制备心肌SR^［2］，Lowry法测定蛋白含量.制备的SR以Jones等^［3］方法测定SRCa²⁺-ATPase活性，结果以mol^．g^-1．h^-1表示.Millipore过滤技术测定ATP依赖的SR⁴⁵Ca²⁺摄取，(⁴⁵CaCl₂，7.2×10³Bq/L，中国原子能研究所提供），SR蛋白浓度0.08g/L～0.14g/L，总反应体积2.0mL，37℃温育4min后加入Na₂-ATP启动反应，分别于1，5，10，15和20min等量吸取200μL以0.45μm滤膜抽滤，2.5mL冲洗液冲洗3次，滤膜室温干燥后以Beckman液闪谱仪测定滤膜放射活性，加ATP与未加ATP滤膜放射活性之差为ATP依赖的SR⁴⁵Ca²⁺摄取量，以μmol^．g^-1表示.

1.2.2RNA斑点杂交异硫氰酸胍法提取总RNA^［4］.RNA变性后以真空抽吸打点仪点于硝酸纤维素膜(每点RNA总量4μg).SRCa²⁺-ATPasecDNA质粒由南巴黎大学Lompre教授^［5］馈赠,18SrRNA作为参比对照.硝酸纤维素膜42℃预杂交16h，切口平移法(切口平移系统购自华美公司)以［α-³²P］dATP(1.48×10¹³Bq/mmol，3.7×10¹¹Bq/L，购自福瑞公司)标记探针.42℃杂交过夜，0.1×SSC/0.001×SDS洗膜后暗室内压χ光胶片，-20℃曝光3d，自动洗片机洗片.杂交显影之χ线胶片以ShimadzuCS-9000型薄层扫描仪图像处理，计算机自动计算灰度值.各样本测得的灰度值与参比对照探针18S灰度值(SRCa²⁺-ATPase/18S)的比值作为各自SRCa²⁺-ATPasemRNA的相对表达量.小样本方差分析q检验进行比较,P＜0.05为相差显著.

2结果

2.1SRCa²⁺-ATPase活性及⁴⁵Ca²⁺摄取4℃～12℃组SRCa²⁺-ATPase活性与对照组相近（P＞0.05)，16℃和20℃组SRCa²⁺-ATPase活性较对照组明显减低（P＜0.01，Fig1）.SR摄Ca²⁺初速率4℃～12℃SR摄⁴⁵Ca²⁺初速率与对照组比较相差无显著性（P＞0.05），16℃和20℃组SR摄⁴⁵Ca²⁺初速率明显低于对照组（P＜0.01,Fig2）,降幅分别为19%和20%.

图1SR Ca²⁺-ATPase 活性

fig1SR Ca²⁺-ATPase activity^bP＜0.01 vs control(C).

图2SR 摄钙初速率

fig2SR Ca²⁺ uptake rate^bP＜0.01 vs control(C).

2.2SRCa²⁺-ATPasemRNA表达各实验组SRCa²⁺-ATPasemRNA均有不同程度表达上调，4℃～16℃组相对表达量为对照组的1.18倍～1.32倍，统计学比较相差无显著性(P＞0.05)，20℃组相对表达量为对照组的1.64倍，相差显著(P＜0.05).

2.3超微结构4℃～16℃组超微结构保护效果基本相近,心肌线粒体结构基本完整,仅见局灶性线粒体嵴溶解；20℃组见有轻度线粒体肿胀及散在嵴溶解，肌丝排列略紊乱.

图3SRCa²⁺-ATPase mRNA 表达

fig3Dot blot analysis of RNAs from control(C) and arrested hearts

a：18S；B：SRCa²⁺-ATPase.

3讨论

本结果显示，CBC虽具降低代谢及提供有氧代谢的双重作用，但16℃和20℃组SR Ca²⁺-ATPase活性、钙摄取能力减退及心肌超微结构有不同程度受损，提示心肌仍有缺血性损害.心肌停搏期温度为决定心肌氧耗量(MVO₂)的重要因素.20℃心肌MVO₂为3mL^．min^-1．kg^-1，温度降至10℃以下MVO₂则减至1.4mL^．min^-1．kg^-1［6］.由于CBC间断灌注心肌无法获得持续氧供,低温降低代谢可弥补CBC的氧供不足.本实验4℃～12℃组SR泵功能保护效果优于16℃和20℃组，提示CBC低温保护的有效性.Holman等^［7］对CBC氧解离关系的研究证实，心肌在15℃以CBC停搏时，氧债量为1.6mL^．min^-1．kg^-1，若将温度降至5℃，氧债量则可降至最低限度，与本实验结果相符,说明CBC心肌保护将温度降至12℃以下具有维持心肌氧供/需平衡的作用.

图4SRCa²⁺-ATPasem RNA表达量

fig4Values of the SRCa²⁺-ATPase/18S hybridization signals^aP＜0.05 vs control(C).

本研究结果还表明，CBC心肌保护SRCa²⁺泵功改变时，其编码基因亦相应的转录表达.近年对心肌抑顿机制研究证实，心肌缺血后转录表达改变的基因可达150余种，其中一些立即早期基因，如c-foc，c-junmRNA表达上调与损伤后修复的基因调控机制有关^［8］.目前对缺血后SRCa²⁺-ATPasemRNA表达上调的途径和机制尚不明确，但对甲状腺功能低下的大鼠注射甲状腺素(T₃)2h后即有SRCa²⁺-ATPasemRNA表达上调^［9］.Frass等^［10］的研究亦提示，心肌温缺血10min，即出现SRCa²⁺-ATPasemRNA表达上调，说明缺血后SRCa²⁺-ATPasemRNA表达上调为快反应过程.我们观察到20℃组SRCa²⁺-ATPasemRNA表达显著上调，可能与缺血后细胞内pH下降，乳酸聚集，氧自由基损伤等造成心肌SRCa²⁺-ATPase活性减弱及钙运转异常，经CRE反应元件(Ca²⁺和cAMP反应元件)增加SRCa²⁺-ATPasemRNA转录活性，启动可逆性SR泵功能损伤的特异修复有关^［10,11］.

本研究初步提示，温度因素影响CBC对离体心肌保护的效果，但对临床心肌保护如何将温度降至10℃以下及对在体心脏是否具有相同的保护效果则有待进一步研究证实.

致谢本研究承生物化学教研室王成济教授,惠宏襄副教授的指导和帮助，赵永同博士在实<