第一军医大学学报1999年第19卷第5期

肖中举 苏 平 高天明 佟振清

摘 要为研究急性分离大鼠皮层神经元上ATP敏感钾通道的特性，本实验采用了膜片钳技术之膜内面向外记录方法。ATP敏感钾通道电导为200 pS左右，翻转电位为0 mV，有外向整流现象；通道开放常呈簇状猝发样开放，平均开放时间和开放概率随去极化程度增大而增加，随超极化程度增大而减少；低浓度ATP有促进通道开放作用，并可激活二级电流；高浓度ATP抑制通道开放概率随浓度增大而增强； ATP浓度增高到1或2 mmol/L时，通道电流被阻断。0.1 mmol/L 优降糖可立即抑制通道活动。急性分离的皮层神经元上ATP敏感钾通道特性与培养神经元有差别；低浓度ATP可激活ATP敏感钾通道，防止神经细胞过度兴奋，从而起到保护脑缺血缺氧损伤的作用。

关键词：ATP敏感钾通道膜内面向外式记录皮层神经元

目前对中枢神经系统ATP敏感钾通道（K_ATP通道）的生理作用还知之甚少。Ohno-Shosaku^[1]在培养的大鼠皮层神经细胞膜上记录到K_ATP通道电流，并认为K_ATP通道在脑缺血缺氧改变中有重要的作用。而Blatz等^[2]认为：培养的神经细胞受人工培养环境的影响，自身特性改变较大，急性分离的神经细胞却能相对保持完好的生理特性。我室在NaCN拟缺氧条件下，采用膜片钳贴附式记录方法记录到一类去极化激活的优降糖敏感钾通道电流^[3]。本实验采用膜片钳技术的内面向外式记录方法，对急性分离大鼠大脑皮层神经细胞膜上K_ATP通道特性进行进一步研究。

1 材料和方法

1.1 大鼠皮层神经元的急性分离 取3～7日龄SD大鼠，断头取大脑皮层，切成厚约0.4 mm的冠状脑片，置于通有95%O₂和5%CO₂混合气体的人工脑脊液[ACSF(mmol/L)：NaCl 142, KCl 5, CaCl₂ 2, MgSO₄ 2, D-Glucose 10, HEPES 10, pH 7.3] 中孵育1 h后，再在通有95%O₂和5%CO₂混合气体的0.1%胰蛋白酶（用ACSF配制）溶液中消化30 min 。消化好的脑片以ACSF冲洗、剪碎，于ACSF中以玻璃吸管吹打成细胞悬液，并移数滴至覆盖有多聚赖氨酸的盖玻片上，待细胞贴壁后，置浴槽进行实验。浴槽液成分为（mmol/L）：KCl 140, CaCl₂ 0.9, EGTA 1, MgCl₂ 1, HEPES 10, pH 7.3(KOH)。整个实验在18～25℃下进行。

1.2 单通道电流记录 本实验采用膜片钳技术的内面向外式方法记录单通道电流。经火抛光的玻璃微电极直径0.6～1m m，电阻8～10 MW ，微电极内充灌电极内液（mmol/L）：KCl 140,CaCl₂ 2, EGTA 1, MgCl₂ 1, CdCl₂ 0.2, HEPES 10, pH 7.3 (KOH)。玻璃微电极由氯化银乏极化电极与CEZ-2200膜片钳放大器（日本光电公司）连接，电流信号通过四级低通滤波器滤波（频率1～3 kHz）后以RMG-5204四通道磁带记录仪（日本光电公司）记录。

1.3 实验步骤 玻璃微电极经微电极操纵器（PF5-1, Narishige）推入浴槽与细胞接近，轻抽吸微电极，使细胞膜与玻璃微电极尖端紧密封接（电阻＞10 GW ）；然后快速提起微电极，使电极下的膜片与细胞分离，形成内面向外式记录形式。由膜片钳放大器在+80～-80 mV范围内输出钳位电压，观察膜片上离子通道电流变化情况。选一易感钳位电压，待记录电流稳定后，于浴槽中加入不同浓度(0.001, 0.01, 0.1, 1, 2 mmol/L) ATP和0.1 mmol/L优降糖，观察ATP和优降糖对通道电流的影响。

1.4 实验试剂 多聚赖氨酸（Poly-L-lysine）、胰蛋白酶、三磷酸腺苷钾盐（K₂-ATP）、优降糖、氯化镉均来源于Sigma公司，EGTA属进口分装，HEPES来自日本Dojindo，乳酸由广州生产，其余试剂来自国内制剂公司。

1.5 数据分析 用TL-1型125 kHz Labmaster DMA数据采集系统接口和Pclamp (5.5.1 Axon Instrument USA)采集程序将原始数据采入计算机(Casper, PC 386/33)，以 Pclamp分析程序进行自动测量，并进行通道电流幅度、通道开放时间和关闭时间等统计学处理。采样频率（数字化水平）5～10 kHz，测量开关忽视水平300 m s。全部数据用均数± 标准差表示，参数比较用t检验，P＜0.05 为相差显著。

2 结果

2.1 通道电流及电导 内面向外式记录形成后，由膜片钳放大器在± 80 mV范围内递级(± 10 mV)输出钳位电压，可记录到一类双向单通道电流。在同一钳位电压下，通道电流幅度基本相同，呈波宽不等的矩形方波，其幅度分布直方图呈对称单峰状，并能很好地进行高斯拟合（图1）；其幅度随超极化或去极化程度加大而增大，钳位电压为正值时，电流-电压（I-V）曲线近似直线，钳位电压为负值时，则为递增幅度逐步减小的曲线；通道电导为（204± 11.72）pS(n=33)，翻转电位为0 mV（图2A）。

图1 急性分离大鼠新皮层神经元内面向外膜片上的单通道电流及通道开放幅度直方图和高斯拟合曲线

Fig. 1 Single channel currents (A) recorded in an inside-out patch of the neuron acutely isolated from rat neocortex, amplitude histogram and Gaussian fit (B) for channel opening. Vp = -40 mV. The channel openings are upward deflections.

2.2 通道的动力学特性

2.2.1 簇状猝发样开放和闪动样关闭 通道开放常呈簇状(cluster openings)和猝发样开放(burst openings)。在连续的一群簇状开放之间常为较长时间(＞10 ms)的关闭。猝发样开放之间常见短于2 ms的闪动样关闭。通道开放时间及关闭时间呈指数分布，需进行双指数拟合。钳制电压－40 mV时，两开放时间常数t _o1、t _o2分别为1.18 ms和44.74 ms，其中长成分占46.3%，短成分占53.7%；两关闭时间常数t _c1、t _c2分别为0.22 ms和2.29 ms，其中长成分占33.4%，短成分占66.6%。。

2.2.2 通道开放概率 通道开放概率是指通道开放时间与总记录时间的比值（Po）。去极化时，通道的平均开放时间和开放概率随去极化程度增大而增加；超极化时，通道的平均开放时间和开放概率随超极化程度增大而减少（图2B）。

图2 K_ATP通道I-V曲线及通道开放概率与钳位电压的关系

Fig. 2 I-V curve of K_ATP channel (A) and the relationship between open probabilities of the channel and clamp voltage (B).

2.2.3 通道的时间依赖性失活 所记录到的通道有近一半(n=15)表现出时间依赖性激活现象：即电压钳制开始时，通道开放概率较低，开放时间短，以单开放为主；随电压钳制时间延长，通道开放概率增加，开放时间延长，出现猝发样开放和簇状开放，且在3～15 s内稳定在最大开放。

2.3 通道对ATP的敏感性 当浴槽液中ATP浓度为0.001 mmol/L时，ATP对通道的开放有促进作用：Vp = +40 mV时，通道开放概率由无ATP的（0.123± 0.042）增大到（0.421± 0.095） (n=12, P＜0.01) （图3A.b），并可激活二级开放（图3A.c）；随ATP浓度增加，ATP对通道开放概率的抑制作用逐步增强，当浴槽中ATP浓度逐步增高到1或2 mmol/L时，通道电流被阻断（n=14, 图3A.d, 3B）。

图3 ATP及优降糖对K_ATP通道电流的影响，以及不同ATP浓度对通道开放概率的影响

Fig. 3 The effects on K_ATP channel current by application of ATP and glybenclamide in bath solution (A, the openings in a,b,d,e are upward and that in c is downward ) and the open probabilities (Po) with various concentration of ATP in bath solution (B).

2.4 优降糖对通道的抑制作用 当浴槽液中加入0.1 mmol/L 优降糖（K_ATP通道的特异性阻断剂）时，通道活动立即受到抑制并阻断（图3）。

3 讨论

本实验中浴槽液的K⁺浓度（膜片内[K⁺]_i）与电极液的K⁺浓度（膜片外[K⁺]_o）相等，均为140 mmol/L，膜通道的K⁺平衡电位应为0mV，与通道翻转电位一致，即表明通道可能选择性地通透K⁺。在钳位电压一定时，电流幅度均一，呈均匀正态分布，是单通道电流。电极液和浴槽液均不含Na⁺，并用EGTA络合浴槽液中的Ca²⁺，用CdCl₂阻断膜片上Ca²⁺流通，该通道不是Na⁺、Ca²⁺通道。而Cl^－通道电流一般不易记录到^[2]，且电导极大（约400～430 pS），故实验所记录到的单通道电流亦不可能是Cl^－<