第一军医大学学报1999年第19卷第5期

肖中举 苏 平 高天明 佟振清

摘要在193例急性分离大鼠皮层神经元内面向外式记录膜片上，记录到2例能为ATP和优降糖所阻断的含有亚电导的通道电流。其电流幅度分布直方图符合高斯分布，并能很好地进行二级拟合；主电导水平分别为191.8 pS 和194.5 pS，亚电导水平分别为153.2 pS和116.1 pS；亚电导成份分别占单位事件总数的35.05%和29.84%；通道活动呈高电流水平与低电流水平交替开放状态，没有高低电流叠合现象。这些结果表明这种K_ATP通道的多电导开放电流不是两个或多个独立通道的开放所致，而是同一通道的不同亚型状态交互活动（即高电导和低电导状态相互转换）的表现。从而提示神经细胞膜上的K_ATP通道可能受某种或某些膜内外环境的变化影响导致其构象改变，从而引发多种亚型交替活动现象。

关键词：亚电导ATP敏感钾通道皮层神经元

就我们所阅读的数百篇关于ATP敏感钾(K_ATP)通道文献来看，运用膜片钳技术所记录到的K_ATP通道特性多有不同；检索Medline1988以来的文献，报导离子通道亚电导(subconductance)特性的只有5篇^[1～5]，只1篇报道K_ATP通道亚电导特性。我室在研究急性分离大鼠皮层神经元上K_ATP通道时，记录到K_ATP通道的亚电导状态，介绍如下。

1 材料和方法

1.1 大鼠皮层神经元的急性分离 取3～7日龄Sprague-Dawley大鼠，断头取大脑皮层，切成厚约0.4 mm的冠状脑片，置于通有95%O₂和5%CO₂混合气体的人工脑脊液[ACSF(mmol/L)：NaCl 142, KCl 5, CaCl₂ 2, MgSO₄ 2, D-Glucose 10, HEPES 10, pH 7.3] 中孵育1 h后，再在通有95%O₂和5%CO₂混合气体的0.1%胰蛋白酶（用ACSF配制）溶液中消化30 min。消化好的脑片以ACSF冲洗、剪碎，于ACSF中以玻璃吸管吹打成细胞悬液，并移数滴至覆盖有多聚赖氨酸的盖玻片上，待细胞贴壁后，置浴槽进行实验。浴槽液成分为（mmol/L）：KCl 140, CaCl₂ 0.9, EGTA 1, MgCl₂ 1, HEPES 10, pH 7.3(KOH)。整个实验在18～25℃下进行。

1.2 单通道电流记录 采用膜片钳技术的内面向外式方法记录单通道电流。经火抛光的玻璃微电极尖端直径0.6～1 m m，电阻8～10 MW ，微电极内充灌电极内液(mmol/L)：KCl 140,CaCl₂ 2, EGTA 1, MgCl₂ 1, CdCl₂ 0.2, HEPES 10, pH 7.3(KOH)。玻璃微电极由氯化银乏极化电极与CEZ-2200膜片钳放大器（日本光电公司）连接电流信号通过四级低通滤波器滤波（频率1～3 kHz）后，以RMG-5204四通磁带记录仪（日本光电公司）记录。

1.3 实验步骤 玻璃微电极经微电极操纵器（PF5-1, Narishige）推入浴槽与细胞接近，轻抽吸微电极，使细胞膜与玻璃微电极尖端紧密封接（电阻＞10 GW ）；然后快速提起微电极，使电极下的膜片与细胞分离，形成内面向外式记录形式。由膜片钳放大器在+80～-80 mV范围内逐级(10 mV)输出钳位电压，观察膜片上离子通道电流。然后于浴槽中加入 ATP (2 mmol/L)和优降糖（0.1 mmol/L），观察ATP和Glib 对通道电流的阻断作用。

1.4 实验试剂多聚赖氨酸 (Poly-L-lysine)、胰蛋白酶 (Trypsin)、三磷酸腺苷钾盐 (K₂-ATP)、优降糖、氯化镉 (CdCl₂)均来源于Sigma公司，EGTA进口分装，HEPES日本Dojindo，其余试剂来自国内制剂公司。

1.5 数据分析 用TL-1型125 kHz Labmaster DMA数据采集系统接口和Pclamp (5.5.1 Axon Instrunent USA)采集程序将原始数据采入计算机(Casper, PC 386/33)，以 Pclamp分析程序进行自动测量及分析。采样频率5～10 kHz，测量开关忽视水平300 m s。

2 结果

2.1 通道电流及电导 在近193例内面向外式记录膜片上，仅记录到2例能为ATP和优降糖所阻断的含有亚电导的通道电流；1例在Vp = -20 mV时，高电流水平为-3.836 pA，低电流水平为-3.064 pA(图1），另1例在Vp = +40 mV时，两电流水平分别为7.78 pA、4.644 pA。高低电流无重叠，呈独立交替出现；其电流幅度分布直方图符合高斯分布，并能很好地进行二级拟合(图2)，其主电导水平分别为191.8 pS 和194.5 pS，亚电导水平分别为153.2 pS和116.1 pS；亚电导成分分别占单位事件总数的35.05%和29.84%，均比主电导状态出现的概率低。

图1 膜片钳位电压-20 mV时K_ATP通道的双电导状态

Fig .1 Two conductance states observed in a single K_ATP channel at patch membrance potential of —20 mV

Openings were downward. Subconductance state indicated by underlining

图2 膜内面向外记录的单通道电流直方图

Fig. 2 Amplitude histogram of single channel currents in one inside-out patch

The two peaks in the distrbutions of current amplitudes were fitted by the sum of two Gaussian components. Vp=+40mV

2.2 ATP和优降糖对通道电流的阻断 2例含有亚电导的通道电流均能被2 mmol/L ATP及0.1 mmol/L 优降糖所阻断(图3)。

图3 ATP和优降糖对双电导单通道电流的阻断作用

Fig .3 Single channel currents with two subconductance states blocked by ATP and glibenclamide (Glib)

A: Control; B: after application of ATP; C: after application of Glib

3 讨论

本实验采取膜内外对称高K⁺浓度(140 mmol /L)，电极液和浴槽液均不含Na⁺，用CdCl₂阻断膜片上Ca²⁺通道，因此所记录到的通道电流不可能是Na⁺和Ca²⁺离子通道电流；而Cl^－通道电导极大（约400～430 pS）一般在内面向外式膜片上不易记录到^[1]，故实验所记录到的通道电流为K⁺通道电流。该钾通道电流能被ATP及K_ATP通道特异性阻断剂优降糖所阻断，即可确定该通道为ATP敏感钾通道。

本实验膜内面向外式记录的含亚电导状态的主电导在200 pS左右，与我们所记录的单电导K_ATP通道的电导水平一致。通道活动呈高电流水平与低电流水平交替开放状态，没有高低电流叠合现象；如两电导水平各属不同的通道，即便是同时一致开放的概率很低，在长时间的记录中也应有叠合电流出现；表明这种K_ATP通道的多电导开放电流不是两个或多个独立通道的开放所致，而是同一通道的不同亚型状态交互活动（即高电导和低电导状态相互转换）的表现。

Harata^[2]近来报导在大鼠CA₁锥体神经元上GABA激活Cl^－通道有三种亚电导状态，Thrower ^[1]、Hernandez ^[3]及Morris ^[4]等记录到Ca²⁺通道也有多种亚电导状态，但均没阐述其机制；Fan ^[5]在心肌细胞胞浆酸化时，记录到多电导(multiple conductance)的ATP敏感钾通道电流，并认为pH下降到6.5以下时，可能因K_ATP通道构型变化而引起单通道多电导状态。由此我们推测：神经细胞膜上的K_ATP通道可能受某种或某些膜内外环境的变化影响导致其构象改变，从而引发单通道多种电导交替活动现象。其详细机制尚需进一步研究。

作者简介：肖中举，男，1965年出生；硕士，讲师；电话85148363

作者单位：第一军医大学生理教研室，广州，510515

参考文献

1 Thrower EC, Duclohier H, Lea EJ et al. The inositol 1,4,5-trisphosphate-gated Ca²⁺ channel: effect of the protein thiol reagent thimerosal on channel activity. Biochem J, 1996,318(Pt 1): 61

2 Harata N, Wu J, Ishibashi H et al. Run-down of the GABA response under experimental ischaemia in acutely dissociated CA1 pyramidal neurones of the rat. J Physiol (Lond), 1997,500(Pt 3): 673

3 Hernández Cruz A, Díaz Muñoz M, Gómez Chavarín M et al. Properties of the ryanodine-sensitive release channels that underlie caffeine-induced Ca²⁺ mobilization from intracellular store