第四军医大学学报1999年第20卷第11期

卢丙仑刘宝林冯志华洪咏龙

摘要目的:探讨简便、易行的人骨髓成骨细胞体外培养方法，研究骨髓基质细胞在体外培养条件下的成骨能力．方法:抽取人骨髓组织，梯度离心后置于含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液中，培养24 h换液，稳定传代后改用含地塞米松和β-甘油磷酸钠的条件培养液，用倒置显微镜观察、组织化学染色、四环素荧光标记等方法进行观测．结果:传代细胞4 d～5 d即可传代，在条件培养液中2 wk形成多层结构，并聚集成黑色结节．培养细胞ALP染色强阳性，结节四环素荧光标记、钙染色强阳性，Ⅰ型胶原免疫组化染色呈黄褐色．结论:本实验方法所培养的骨髓基质细胞符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，并能在体外形成钙化的新骨组织．

关键词：骨髓细胞培养成骨细胞

0 引言

近年来，越来越多的研究证实骨髓具有潜在的成骨能力，在不同的理化环境和活性蛋白多肽诱导下，骨髓基质干细胞，可定向地向成骨细胞系转化，最终钙化成骨^［1］，是组织工程化骨组织中成骨细胞的重要来源和研究骨组织生物学特性的体外模型．本实验改进了人骨髓细胞体外培养方法，并对其体外成骨能力进行观察．

1材料和方法

1.1材料淋巴细胞分离液（华美生物工程公司），小牛血清（浙江金华清湖犊牛生物制品厂），β-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸、地塞米松及盐酸四环素（Sigma公司，美国），兔抗人Ⅰ型胶原抗体、兔抗人Ⅲ型胶原抗体（博士德公司），ABC免疫组化检测试剂盒（Vector公司）．

1.2方法

1.2.1人骨髓单核细胞的分离、培养参照文献［2,3］，无菌条件下，以含5 mL肝素钠生理盐水(100 U/mL)的20 mL注射器，于健康成年志愿者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织5 mL，移入含5 mL肝素钠盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含10 mL淋巴细胞分离液(Ficoll液)的离心管中，进行梯度离心(3000 r/min×20 min)，离心后，平端吸管吸取单核细胞部分(云雾状层)，以DMEM培养液洗涤2次(800 r/min×5 min)，按1.0×10⁵ cells/mL细胞数接种于25 mL培养瓶内，加入定量含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液，在37℃，50 mL/L CO₂条件下培养，24 h换液，清除未贴壁细胞，而后隔日换液，观察细胞生长情况．细胞融合成片，长满培养瓶底部后，用2.5g/L胰蛋白酶消化，传代培养．

1.2.2人骨髓成骨细胞的鉴定细胞传代至第4代，进入稳定传代期，用于细胞的起源鉴定．

1.2.2.1倒置显微镜观察观察细胞生长速度、形态．

1.2.2.2细胞碱性磷酸酶(ALP)化学染色第4代培养细胞长满后，胰酶消化制成浓度为1×10⁵cells/mL的细胞悬液，接种于事先放入盖玻片的24孔板内，加入定量含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液，培养3 d后取出，4℃生理盐水冲洗，置于冷丙酮中固定15 min，而后用钙钴法染色测定细胞ALP活性，计算阳性细胞百分比．

1.2.2.3Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体免疫组化染色按1.2.2.2方法将成骨细胞和成纤维细胞接种于盖玻片上，培养3 d后取出，40 g/L多聚甲醛4℃下固定15 min，乙醇脱水后吹干，以兔抗人Ⅰ型及Ⅲ型胶原抗体为一抗，按标准ABC检测试剂盒说明进行免疫组织化学染色．阳性为黄褐色．

1.2.2.4细胞生长曲线的测定第5代人骨髓成骨细胞长满后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1×10⁵ cells/mL细胞密度接种于24孔培养板内，加入等量含100 mL/L小牛血清的DMEM培养液，在标准环境下培养，隔日换液．分别于1,2,4,6,8,10 d各取3孔细胞消化后，用细胞计数板计数细胞，每孔重复3次，取均值．绘制细胞生长曲线并测定细胞倍增时间．

1.3人骨髓成骨细胞体外成骨能力取第5代人骨髓成骨细胞，按1×10⁵ cells/mL细胞浓度接种于放有4个条形盖玻片的培养瓶内，于次日加入条件培养液，置于标准环境下培养，每2 d～3d换液1次．连续观察细胞生长情况，记录钙化结节形成过程，培养25 d后取出盖玻片．在取出前加入终浓度为100 μg/mL的四环素溶液，继续培养30 min，然后取出盖玻片，PBS液冲洗3次，置于荧光显微镜下观察．而后用40 g/L多聚甲醛固定，行Von Kossa法钙染色．

2结果

2.1倒置显微镜观察细胞接种后3 h开始贴壁，24 h约有80%贴壁，细胞呈梭形，并开始分裂增殖、积聚，有团簇生长倾向．4 d～5 d细胞体积增大，带有粗大突起，并向多角形转化，1wk细胞长满瓶底，变为细长的梭形．传代细胞生长明显加快，6 h～8 h基本贴壁，呈长梭形或大多角形，4 d～5 d即可传代．改用条件培养液后细胞生长速度明显变慢，1 wk左右细胞长满，并复层生长，胞质内出现黑色颗粒，2 wk细胞聚集成多个细胞结节，呈突起的多层结构，结节逐渐增大呈黑色团块（Fig 1）．

图1培养细胞形态

fig 1The phenotype characterization of the passage culture cells×200

2.2细胞碱性磷酸酶染色ALP阳性细胞胞质呈灰黑色，染色后大部分细胞均呈阳性反应，强阳性细胞多为大多角形，而梭形细胞染色略弱．4条玻片，每片随机选取2个视野，采用网格计数法，计算平均阳性细胞百分率为85.2% (Fig 2) .

图2碱性磷酸酶染色呈强阳性，阳性百分率85.2%

fig 2The cells layer displayed strong positive staining for alkaline phosphatase (ALP) in 85.2% of all cells after 3 days of culture×100

2.3Ⅰ,Ⅲ型胶原免疫组化染色经ABC法染色，Ⅰ型胶原抗体染色细胞胞核周围呈黄褐色，而Ⅲ型胶原抗体染色为阴性(Fig 3).

图3Ⅰ型胶原染色细胞胞核周围呈黄褐色

fig 3Positive staining for procollagen type Ⅰ propeptide was revealed，and the staining was mainly perinuclear×400

2.4细胞生长曲线及倍增时间经测定细胞接种后1,2,4,6,8,10 d细胞数，绘制细胞生长曲线．发现人骨髓成骨细胞体外培养在第2日～6日生长活跃，增殖迅速，为研究细胞生长状态的理想时期．培养第8日后进入细胞增殖稳定期．细胞倍增时间为36 h.

2.5细胞结节钙染色和四环素荧光标记细胞培养2 wk后开始出现结节，并逐渐增大，由透明到不透明的黑色团块．四环素荧光标记后，在荧光显微镜下结节呈明亮的黄色荧光，其亮度与倒置显微镜下结节大小、深浅一致．Von Kossa法钙染色后结节呈棕褐色(Fig 4)．

图4四环素荧光标记后结节呈明亮的黄色荧光

fig 4After 3 weeks of culture the cells were able to form a mineralized matrix．Mineralized area labeled with tetracycline revealed yellow fluorescence×100

3 讨论

体外培养成骨细胞是研究骨代谢和成骨机制的重要手段，而将组织工程化骨用于骨缺损的修复是未来临床治疗的趋势所在．以往培养的成骨细胞多取材于人或动物的骨和骨膜组织，利用具有成骨潜能的骨髓组织培养成骨细胞具有取材方便、对供体损伤小和有流动性可经皮注射等优点，近年来逐渐引起人们的重视和采用．

骨髓可分为造血和基质两大系统，其成骨能力来源于基质系统．早在1869年，Goujon发现骨髓具有成骨能力，Megaw于1934年首次在动物实验上得到证实．研究表明^［4］，机体内骨原细胞有两种类型：诱导性骨原细胞和定向性骨原细胞，骨髓是唯一含有丰富的定向性和诱导性骨原细胞的组织，骨髓组织细胞的应用具有巨大的潜力，如在自体骨髓浓缩，骨腔注射；自体骨髓细胞培养，应用组织工程技术修复重建缺损组织器官等方面有广泛用途．因此，建立快速、有效的人骨髓成骨细胞体外培养方法显得十分必要．

我们在进行人骨髓细胞的分离、培养过程中，对文献［2,3］介绍的方法加以改进，简化了先用300 mL/L马血清加RPMI-1640培养液筛选除去造血等杂质细胞的程序，直接用加入100 mL/L小牛血清的DMEM培养液进行培养，且提前于24 h即进行换液，方法简便、易行．结果表明细胞贴壁时间短，繁殖速度快．通过培养细胞形态学观察，及成骨细胞具有特征性的鉴定^［5］：较高的碱性磷酸酶活性，能够合成Ⅰ型胶原，而不能合成Ⅲ型胶原，证实所培养的