第三军医大学学报1999年第21卷第11期

伍津津刘荣卿叶庆佾唐书谦钟白玉

提要目的：比较毛囊球部和隆突部上皮细胞的增生能力。方法：采用0.5%分离酶将人正常头皮毛囊上皮组织与真皮组织分离，再将毛囊上皮细胞分成上段、下段和球部，然后进行传代培养。结果：上段细胞传代次数最多，形成的克隆数最多，细胞生长活力最强，而球部细胞的生长能力最差，下段细胞有少数能形成进行性生长克隆。结论：毛囊上段细胞的增生能力最强，支持隆突激活假说，即毛囊干细胞定位于隆突部。

关键词：毛囊干细胞上皮细胞

毛囊干细胞是毛囊生物学研究的关键问题，传统认为它们定位于毛球部的生发母质细胞中，因为在生长期时表现出广泛的增生活动，分化出不同细胞，包括毛髓质、皮质、毛小皮、Huxley′s和Henles′层^［1］。近来Lavker^［2］提出了隆突激活假说，认为毛囊干细胞定位于毛囊隆突部，即立毛肌附着点。干细胞的一个重要特征是它比短暂倍增细胞有更高的增生潜能。因此，将毛囊上皮细胞分段对比研究其增生能力，有助于本问题的阐明。这里我们报道的是将毛囊分成上段、下段和球部，通过传代培养来比较其增生能力。

1材料与方法

1.1标本来源和处理

本实验的头皮取自急症创伤青年病人尸体，包皮取自包皮环切术后的正常包皮。头皮剃毛后70%酒精擦2遍，用D-Hanks液洗3遍，头皮切成0.3～0.4 cm宽的皮条，然后从真皮皮下组织交界处剪开，将下部毛囊从皮下组织中拔出，下部毛囊的上皮组织从其真皮鞘中挤出，采用0.2%胶原酶消化法分离毛乳头和真皮鞘细胞，其培养参见文献［3］报道。人真皮成纤维细胞由头皮或包皮的真皮组织按组织块法培养而来。均用10%新生牛血清DMEM培养，每周换液2次。

1.2分段毛囊角朊细胞的游离

头皮条在真皮皮下组织交界处剪开后用0.5%分离酶(Sigma)PBS液4℃孵育16～18 h，然后分离表皮、真皮，剪下随表皮分下来的毛囊上皮组织真皮段及从真皮组织中挤出毛囊上皮组织的真皮段(即毛囊上段)；从皮下组织中轻轻挤出下部毛囊的上皮组织(毛囊皮下组织段)，在解剖显微镜下将其分成下段和球部，上述4种上皮细胞，毛囊间表皮、毛囊上段、下段和球部，用0.125%胰酶和0.02% EDTA在37℃下孵育，按不同时间消化，毛囊间表皮25～30 min，上段20～25 min，下段15～20 min，球部15 min，5%新生牛血清D-Hanks液中止消化，吹散，过筛网，计数，离心。毛囊上段细胞代表除漏斗部和皮脂腺的毛囊真皮段外根鞘细胞，毛囊下段细胞代表除球部的毛囊皮下组织段外根鞘细胞，毛球部细胞即毛母质细胞。

1.3传代培养

滋养细胞采用人真皮成纤维细胞、真皮鞘细胞制作，细胞融合后用含有丝裂霉素C(6.7 μg/ml，日本Kyowa Happo Kogyo Co.Ltd)的DMEM培养基(含10%新生牛血清)在37°C下孵育10 h，传代，每个25 ml培养瓶接种1×10⁵个细胞。

上述4种角朊细胞培养于已经丝裂霉素C处理的人真皮成纤维细胞滋养层上进行培养，每25 ml培养瓶按5×10⁵个细胞接种，角朊细胞融合后用0.5%分离酶分离后胰酶消化，进行传代培养，每25 ml培养瓶按2×10⁵个细胞接种，瓶中用人真皮成纤维细胞或真皮鞘细胞作滋养层。培养基为含有EGF(10 ng/ml)、胰岛素(5 μg/ml)、氢化可的松(0.4 μg/ml)和10%新生牛血清的DMEM。

2结果

毛囊间表皮、毛囊上段、下段和球部的角朊细胞培养在滋养层细胞上表现不同的增生能力。表皮角朊细胞生长很好，能传2～3代，而上段外根鞘细胞生长非常好，能传3～4代，且融合时间短于毛囊间表皮角朊细胞，上段细胞3 d即可融合，而表皮细胞需要5 d。下段毛囊角朊细胞原代生长较好，长成局灶性克隆但不能融合传代，球部细胞生长很差，即使是原代。从形成的克隆形态来看，表皮细胞形成的大克隆其细胞体积较大，上段毛囊细胞形成较均一的中等克隆，细胞体积较小，见图1 a、b，克隆数目最多，约占毛囊克隆总数的74%，下段毛囊细胞和球部细胞形成的克隆小，细胞较大，并显示出较高的分化状态，克隆数分别16%和10%，见图1 c、d。在下段细胞中还形成了进行性生长的克隆，见图2。另外当毛囊下段细胞培养在真皮鞘细胞滋养层细胞上时形成了一个特殊的结构，象钉突状，见图3。上皮细胞的排列象毛囊球部一样，外层呈栅栏状排列。

图1 a毛囊间表皮角朊细胞克隆形成情况(培养1 d)细胞克隆较大(×100)

fig 1 aLarge cell coloies formation of the interfollical epidermal keratinocytes 1 d after culture(×100)

图1 b毛囊上段角朊细胞克隆形成情况(培养1 d)细胞克隆较小、较均一(×100)

fig 1 bSmaller and uniformed cell colonies formation of the keratinocytes from superior follicle 1 d after culture(×100)

图1 c毛囊下段角朊细胞克隆形成情况(培养3 d)细胞克隆较大(×100)

fig 1 cLarge cell colonies formation of the keratinocytes from inferior follicle 3 d after culture(×100)

图1 d毛囊球部细胞克隆形成情况(培养3 d)细胞呈高分化状态(×100)

fig 1 d Highly differentiated cell colonies of the bulb matrical cells 3 d after culture(×100)

图2毛囊下段角朊细胞培养在成纤维细胞滋养层上有进行性生长的克隆形成(×100)

fig 2Continuous growing colony of the keratinocytes from inferior follicle when cultured

on fibroblast-feeder layer(×100)

图3毛囊下段角朊细胞培养在真皮鞘细胞滋养层上形成了似钉突状的细胞克隆(×200)

fig 3Pike-like structure of colony of the keratinocytes from inferior follicle when culturedon dermal sheath cell-feeder layer(×200)

3讨论

毛囊干细胞的定位还存在着争论^［4］，一般认为毛囊干细胞定位于毛球部的毛母质细胞中。而Cotsarelis^［5］研究发现仍留有³H胸腺嘧啶核苷的毛囊细胞是位于毛囊隆突部，于是他们提出了隆突激活假说。我们的结果提示从含有隆突部毛囊区来的角朊细胞比毛囊间表皮、毛囊下段和球部细胞有更长的寿命和快速增长的能力，与Yang^［6］和Moll^［7］的结果相符，说明毛囊上段含有一群体外增生潜能极强的细胞亚群。从克隆形态来看，上段毛囊细胞的克隆数最多，活力最强。Kobayashi等^［8］研究显示的大鼠触须隆突部细胞所形成的克隆数占毛囊细胞总克隆数的95%以上，高于我们的上段与下段克隆数之和。与Moll^［7］结果略有差异，这可能与取材不同有关，他取的为拔出的毛囊，部分下段和球部细胞仍会遗留在体内。在游离毛囊培养中也显示毛囊上段是上皮细胞最早的生长点，此点与Regauer^［9］和Yang^［6］结果一致，支持毛囊干细胞定位于隆突部的假说。

另外，下段细胞在由真皮鞘细胞滋养层上时形成了一个钉突状结构，这相似于早期Reynolds^［1］的研究工作，他们显示触须生发细胞当培养在毛乳头细胞上形成的一个更为复杂的器官型样结构，不同的是我们培养在经丝裂霉素处理的真皮鞘细胞上，然而毛囊上段、球部和毛囊间表皮细胞没能形成这种复杂的结构。这可能是由于毛囊下段细胞和真皮鞘细胞在体内时结构关系便很紧密。从这个特殊结构形态来看，下段角朊细胞似乎重建一种似于毛囊基底部的细胞排列，提示下段毛囊角朊细胞向毛母质细胞分化而不是向表皮分化，这符合隆突激活假说中的想法，隆突部的细胞产生一组芽细胞，这些芽细胞穿过下部毛囊(即峡部)向毛母质角朊细胞分化，这个钉突状结构的形成很可能是某些特殊的刺激因子如真皮鞘细胞分泌的生长因子或是两种细胞直接紧密接触作用结果。这也说明下段毛囊可能具有诱使真皮鞘细胞转化成毛乳头细胞的能力。近来有研究报道显示，生发上皮细胞和真皮鞘细胞一同植入皮肤后形成了较大的