摘要: 目的构建在E.coli中表达人La多肽的质粒。 方法以人脾cDNA为模板,通过PCR获得La多 肽(全长)的DNA片段。将此片段利用双酶切定向克隆到MBP(麦芽糖结合蛋白)融合系统的载体pMAL^TM-c中 ， 表达可溶性融合蛋白，并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验(IBT)证明, 表达的融合蛋白具有La抗原多肽的特异性,而敏感性超过生化制备的ENA制品。 结论重组融合蛋白与天然ENA制品存在免疫学同一性。

中图号 : Q55文献标识码：A 文章编号： 1007－8738(2000)03－0207－04

Cloning and expression of a fusion protein with human La polypeptide in E.coli

ZHAO Xiao-yuLIU Jian-rongJING Tian-yuWANG Hui-wenWANG Yan-fangWANG Xi-ming

（Institute of Biotechnology, Hebei University, Baoding 071002, Hebei Province, China ）

Abstract: Aim To construct a vector expressing human La polypeptide in E.coli. Methods The full length DNA fragment encoding La polypeptide was obtained by PCR from human spleen cDNA. The La DNA fragment was cloned into plasmid pMAL c(a maltose binding protein, MBP fusion vector) and expressed in E.coli. The soluble MBP La fusion proteins were purified by affinity chromatography using amylose resin. Results Western blot showed that the fusion protein could react with anti La antibody as the natural La polypeptide, and the sensitivity was higher than natural antigen. Conclusion The fusion La polypeptide has the immunoidentity with natural La polypeptide. length DNA fragment encoding La polypeptide was obtained by PCR from human spleen cDNA. The La DNA fragment was cloned into plasmid pMAL c(a maltose binding protein, MBP fusion vector) and expressed in E.coli. The soluble MBP La fusion proteins were purified by affinity chromatography using amylose resin. Results Western blot showed that the fusion protein could react with anti La antibody as the natural La polypeptide, and the sensitivity was higher than natural antigen. Conclusion The fusion La polypeptide has the immunoidentity with natural La polypeptide.

Kaywords:La antigen;PCR; cloning; expression; fusion protein ▲

La(又名SSB)抗原是存在于哺乳动物细胞核中的一种小核RNA/蛋白质复合物(smallnuclearribonucleoproteincomlexes,snRNP)，即LaRNP。它是由相对分子质量(Mr)为47000的多肽(磷蛋白)与小核RNA组成^〔1〕。这些小核RNA包括7SRNA，5SRNA和tRNA前体，以及某些病毒RNA(如:VARNA和EBERRNA^〔2，3〕)。La抗原作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止因子,在基因调控中起重要作用^〔4〕。临床上干燥综合症(Sjogren'ssyndrome)和系统性红斑狼疮(SLE)等患者体内往往存在抗La抗体，通常利用含有La抗原的可提取性核抗原(ENA)制品检测患者体内的抗La抗体,可为临床鉴别与诊断上述疾病提供依据^〔5〕。

实验证明，La抗原的抗原决定簇在La多肽上^〔7，8〕。我们根据文献报道的编码La多肽的DNA序列^〔1〕设计引物,通过PCR扩增获得编码La多肽的特异性DNA片段。将该片段克隆到pMALTM-c表达载体中，在大肠杆菌中以麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白的的形式得到表达，并通过亲和层析获得纯化。

1材料和方法

1.1材料载体pMALTMc，amyloseresin和兔抗MBP抗血清，为NewEnglandBiolabs公司产品。IPTG，Xgal和T4连接酶，为Promega公司产品。人脾QuickCloneTMcDNA为Clontech公司产品。DH5α和BL21来自中科院生物物理所。PVDF膜为Gelman公司产品。抗La抗体阳性血清来自天津长征医院免疫室。引物由上海生工生物有限公司合成。HRP－羊抗人IgG和HRP－羊抗兔IgG，购于北京生物制品研究所。人脾和猪脾ENA为河北大学生物工程公司产品。

1.2方法

1.2.1La质粒的构建我们所用载体pMALTMc(简称pc)为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合系统。依据人La多肽编码序列^〔1〕设计一对引物,以人脾cDNA为模板进行扩增获得DNA片段。选择pc的多克隆位点(polylinker)中EcoRI和SalI两个酶切位点作为外源DNA的插入点，通过T4DNA连接酶将该片段与pc定向连接,并转化到DH5α受体菌中,在含有IPTG和Xgal的培养基上筛选白色重组子。

1.2.2免疫印迹实验(IBT)样品经100g/LSDSPAGE电泳后,用Minitransblotelectrophoretictransfercell(BIORAD)电转移到PVDF膜上,以50g/L脱脂奶粉封闭。然后相继与抗血清(一抗)、HRP－羊抗人IgG或HRP－羊抗兔IgG(二抗)反应,DBT显色。

1.2.3DNA序列测定以pMALTMc系统malE的正、反向引物,对阳性克隆质粒的插入片段进行DNA序列分析(北京赛百盛公司产品)。

1.2.4La多肽融合蛋白的纯化菌体经超声破碎、抽提后，取上清液通过amyloseresin柱，用10mmol/L麦芽糖洗脱。收集洗脱物置低温保存。

1.2.5亲和层析纯化抗体将人脾ENA包被在PVDF膜上，与抗La抗体阳性血清反应后，用甘氨酸洗脱，经1mol/LTris盐中和后，低温保存。

2结果

2.1La多肽编码DNA片段的扩增根据文献〔1〕报道,本实验设计的PCR引物为：SN:5′GCCGTAATGGCTGAAAATGG3′;ASN:5′CGAAGTGGACCTAATTCGG3′,其中5′端分别加上EcoRI和SalI酶切位点。按此设计要求扩增片段的长度应该为1342bp。以人脾cDNA为模板,利用上述引物进行扩增,扩增条件为:首先94℃变性1min;然后94℃0s，48℃2s，72℃30s，30个循环后,72℃再延伸1min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后,显示出1条长度约为1.4kb的DNA片段(图1)。

图1PCR扩增的LaDNA片段的琼脂糖凝胶电泳

Fig1AgarosegelelectrophoresisofLaDNAamplifiedbyPCR

M:λDNA/HandIII＋EcoRI(21207,5048,4973,4268,3530,2027,1904,1586,1375,947,831,564bpfromtoptobottom);

1:AmplifiedDNAsegmentencodingLapolypeptide.

2.2La质粒的构建和阳性克隆的筛选按1.2.1获得许多白色菌落。对这些菌落分别进行培养和诱导，菌体进行SDSPAGE后，检查蛋白质的表达情况。同时，经电转移(Westernblot)至PVDF膜上，筛选既能与亲和洗脱的抗La抗体反应，又能与抗MBP抗血清反应的阳性克隆。如图2所示，阳性克隆77＃和79＃的表达蛋白与p-c明显不同,并与抗La抗体和抗MBP抗体均出现明显的特异性反应,而且与抗La抗体反应的条带均可与抗MBP抗体反应,说明克隆77＃和79＃表达的是MBP与La多肽的融合蛋白。不过与克隆77＃相比较，克隆79＃缺少了1条Mr值最高的带。

图2SDSPAGE和IBT对La阳性克隆的筛选

Fig2ScreeningofLapositiveclonesbySDSPAGEandIBT

A：StainedwithcoomassieblueG250afterSDSPAGE；B:ImmunologicallyreactedtoantiLaantibodyafterWesternblot;

C：ImmunologicallyreactedtoantiMBPantibodyafterWesternblot.a:Induced;b:Notinduced.

ThedigitsinFig2representthenumberofpositiveclones.

2.3阳性克隆插入DNA片段的鉴定分别提取克隆77＃和79＃的质粒,用EcoRI和SalI双酶切后,在琼脂糖电泳中可以看到除质粒片段外,还出现1条1.4kb的带(图3A)。与此同时,以克隆77＃和79＃的质粒为模板，利用上述引物进行PCR扩增,同样得到了1.4kb的条带(图3B)。

以pMALTMc系统malE的正、反向引物,对克隆77＃和79＃质粒中的插入片段进行DNA序列测定,结果与LacDNA序列完全相同,对照结果如图4。

2.4融合蛋白的纯化对克隆77＃和79＃进行培养和诱导,按1.2.4纯化融合蛋白的方法，得到较单一的蛋白质组分。除游离的MBP(Mr为42000)外，克隆77＃含有Mr为90000，65000和55000的组分；而克隆79＃只有后两个组分(图5)。这些组分与图2中的B，C显色区带相同。

2.5融合蛋白(77＃)的La抗原特异性和敏感性

①与天然La抗原(ENA)的免疫学特性相比较:利用对流免疫电泳,将含抗Ro/La抗体的阳性血清与天然La抗原(生化提取的人脾ENA)和融合蛋白(fusionLa)进行反应。如图6所示，抗Ro/La抗体与ENA形成了两条沉淀线，其中靠抗体孔的浓沉淀线是La，另1条弱沉淀线则是Ro。融合蛋白和抗La抗体也形成浓的沉淀线，而且其与ENA的Ro/La形成融合支线，证明融合蛋白与天然ENA制品中的Ro/La抗原具<