摘要：目的观察慢性肾衰(CRF)血液透析(HD)患者中，输血传播病毒(TTV)的感染与患者细胞免疫功能的关系。方法应用巢式逆转录－聚合酶链反应(RTPCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞仪，分别检测了90例CRF血透患者和128例对照组血清TTVDNA，可溶性白细胞介素2受体(sIL2R)和外周血T淋巴细胞亚群。并随机选择对其中1株TTV的部分基因序列进行测定，分析TTV与细胞免疫功能、输血次数、HD时间和肝功能的关系。结果⑴90例CRF血透患者中，TTVDNA阳性率为46.67％，明显高于正常对照组(P∨0.001)，与日本报道的TTVDNA序列(AB008394)相应片段的同源性为98.5％。⑵CRF血透患者血清中，sIL2R水平明显高于正常对照组(P∨0.01)；CD3＋，CD4＋和CD4＋/CD8＋T细胞比例明显降低(P∨0.01)。⑶TTVDNA阳性率与sIL2R、输血次数及HD时间呈显著的正相关(r=0.486，P∨0.01；r=0.586，P∨0.001；r=0.492，P∨0.01)，与CD＋，CD4＋和CD4＋/CD8＋T细胞比例呈负相关(r=0.476，P∨0.01；r=0.483，P∨0.01；r=0.496，P∨0.01)，而与年龄、性别及手术史均无显著的差别和相关性。结论CRF血透患者有严重的TTV感染；其高发生率可能与细胞免疫功能明显低下及其与血液紧密接触有关。

中图号：R629.5文献标识码：A文章编号：1007－8738(2000)03－0242－04

Detection of transfusion transmitted virus(TTV) and the relationship between TTV infection and cellular immunity in hemodialysis patients with chronic renal failure

SUN Ji-fengLI Zhan-tingWANG LIWANG Hui-pingLI Guang-yin

（Department of Nephrology, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China ）

FU En-qing

（Infection Hospital, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China ）

JIAO Kai

（Department of Endocrinology, Tangdu Hospital, Forth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi Province, China ）

Abstract: Aim To investigate the relationship between transfusion transmitted virus(TTV) infection in hemodialysis patients with chronic renal failure(CRF) and cellular immunity. Methods The serum TTV DNA, soluble interleukin 2 receptor(sIL 2R)and T lymphocyte subsets in 90 CRF hemodialysis patients and 128 controls were detected by nested RT PCR,Sandwich ELISA and flow cytometry. Furthermore, a partial sequence of TTV genes was randomly selected and determined. The relationships between TTV and transfusion times, long or short duration of hemodialysis, liver function and cellular immunity were analysed. Results ⑴ The positive rates of detected TTV DNA (46.67％ ) in 90 hemodialysis patients were significantly higher than those in control group(P∨ 0.001)and the homology reached 98.5％ in comparison with the segment of TTV DNA sequences reported by Japanese.⑵ In the serum of hemodialysis patients, sIL 2R level increased significantly in comparison with that in the normal control(P∨ 0.01), and CD3＋ , CD4＋ T cells and CD4＋ /CD8＋ T cells markedly decreased(P∨ 0.01). ⑶ The positive rate of detected TTV DNA was positively correlated with the transfusion times, duration of hemodialysis and sIL 2R level (r=0.586, P∨ 0.001; r=0.486, P∨ 0.01; r=0.492, respectively, P∨ 0.01)， and it was negatively correlated with CD3＋ , CD4＋ T cells and CD4＋ /CD8＋ T cell ratio (r= 0.476, P∨ 0.01; r= 0.483, P∨ 0.01； r= 0.496， respectively P∨ 0.01)， whereas it was not correlated with age, sex and surgery. Conclusion There is a severe TTV infection in hemodialysis patients with CRF, which may be related to the transfusion times and the low cellular immune function.

Keywords: chronic renal failure;hemodialysis;transfusion trans mitted virus； T lymphocyte； soluble interleukin 2 recepter▲

慢性肾衰(CRF)维持性血液透析(HD)患者常伴有细胞免疫功能缺陷，表现在极易发生感染和肿瘤发生率高等^〔1〕。我们采用巢式逆转录聚合酶链反应(RTPCR)，双抗体夹心ELISA法及流式细胞术，分别对HD患者外周血输血传播病毒(TTV)和可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)外周血T淋巴细胞亚群(CD3^＋，CD4^＋T细胞及CD4^＋/CD8^＋T细胞的比例)进行了检测，并随机对其中1株TTVDNA的部分基因序列进行测定，观察了慢性肾衰HD患者中TTV感染情况的同时，分析了TTV感染与患者细胞免疫功能、输血次数、HD时间及肝功能的关系，以进一步了解HD患者的免疫状态。

1材料和方法

1.1材料HD患者90例，正常对照组128例，分为A，B两组。HD组(A)：均为在我院住院的维持性HD患者，其中男47例，女43例，平均年龄52.3岁(24～64岁)，平均HD时间45.6mo(3～108mo)。HD方法采用GambroAK200血透机、CA130醋酸纤维膜中空透析器，血流量300mL/min，常规碳酸氢盐透析液流量500mL/min，每周透析11h，以肝素钠边缘化法抗凝。其原发病为慢性肾炎(54例)、急进性肾炎(3例)、原发性高血压(9例)、糖尿病(15例)及多囊肾(9例)，均有输血史。正常对照组(B)：为健康体检者，其中男71例，女57例，平均年龄51.2岁(20～78岁)。引物设计和主要材料：TaqDNA聚合酶、dNTP和低熔点琼脂糖，均购自华美公司。引物参照文献^〔3〕设计，序列为：

P1：5′GCAGCAGCATATGGATATGT3′；

P2：5′TGACTGTGCTAAAGCCTCTA3′；

P3：5′CTTACACATGAATGCCAGGC3′；

P4：5′GTACTTCTTGCTGGTGAAAT3′.

P1与P2为外引物，P3与P4为内引物，两对引物均位于ORF1保守区，内引物扩增片段的长度为197bp。2400型PCR仪为美国PE公司产品。

1.2方法

1.2.1标本采集和处理A，B两组分别空腹抽血2mL，置于玻璃试管中，离心分离血清。取20μL于经高压灭菌的1.5mL塑料管中，加等量裂解液煮沸10min，再高速离心10min，保存于20℃备用。

1.2.2TTVDNA的检测采用nRTPCR方法。第1次取上清标本2μL为DNA模板，第2轮以第1轮产物2μL为模板，两次PCR反应的体积均为15μL。其中含2.5mmol/LdNTP1μL,2.5mmol/L引物各1μL(第1轮用两条外引物，第2轮用两条内引物)，Taq酶1.5μL，10×Taq酶buffer1.5μL。顶部以石蜡油封闭，均按下列参数进行PCR：94℃30s，56℃30s，72℃30s，共35个循环。开始循环前先于94℃预变性5min，最后于72℃延伸5min。PCR终产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，溴化乙锭染色，紫外线检测仪观察结果，出现197bpDNA扩增带者为阳性。每次PCR中均设有阴性、阳性和空白对照。

1.2.3PCR产物的序列测定扩增产物经7g/L低熔点琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的DNA条带，用原平公司纯化试剂盒进行回收纯化，采用双脱氧链末端终止法直接测序。测序试剂盒购自Promega公司，测序仪为BioRad公司产品。

1.2.4血清sIL2R的测定采用双抗体夹心ELISA法。试剂盒由本校免疫教研室提供，具体操作步骤见说明书。

1.2.5T淋巴细胞亚群的测定取100μL小鼠抗凝全血，加10μLFITC标记的抗CD3^＋,CD4^＋,CD8^＋和IgG鼠抗体(抗体为BeckmanCoullter公司产品)混匀。室温放置15min后，用Qprep自动细胞制备仪，加A、B、C液溶解红细胞和稳定淋巴细胞，轻轻摇10min即用ProfileⅡ型流式细胞仪进行分析(美国Coullter公司)。测定条件：激光光源15mW，氢离子激光，波长488nm，1次检测1000个以上细胞。

2结果

2.1慢性肾衰血透患者TTV-DNA的检测TTVDNA阳性血清均出现197bp异性条带，与预计片段的大小相一致。90例HD患者中TTV-DNA阳性血清份数和比率分别为(42和46.67％)，明显高于对照组(3和2.34％，P∨0.001)，表明HD患者存在着严重的TTV感染。

2.2PCR产物部分基因序列的测定为确定nPCR检测TTV-DNA结果的可靠性，我们随机对1株TTV-DNA阳性的nPCR产物直接进行了序列测定，经与日本报道的TTV-DNA序列(AB008394)相比较，二者的同源性为98.5％(图1)。

2.3CRF血透患者细胞免疫功能的检测90例CRF血透患者和128例正常对照者外周血中T细胞亚群(CD3^＋，CD4^＋和CD8^＋)和CD4^＋/CD8^＋T细胞的比例，以及sIL-2R的水平见表1。

表1CRF血透患者细胞免疫功能的测定(

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