摘要:目的比较点突变p53及其抗原肽重组痘苗病毒诱导的抗瘤免疫反应，为重组抗原疫苗用于肿瘤免疫治疗提供实验依据。方法以人135位Cys→Tyr点突变p53为肿瘤相关抗原模型，观察以表达该点突变p53蛋白的重组痘苗病毒rVVp53FL与表达包含该点突变抗原肽p53125145的重组痘苗病毒rVVp53M所诱导的CTL及对荷瘤Balb/c小鼠的免疫保护和治疗作用。结果rVVp53FL和rVVp53M均能诱导以CD8＋T细胞为主的特异性CTL。用rVVp53FL与rVVp53M免疫小鼠后，接种致死剂量的P815mp53细胞，能保护部分小鼠免遭致死剂量肿瘤细胞的攻击。小鼠接种致死剂量的肿瘤细胞后，以rVVp53FL与rVVp53M治疗荷瘤小鼠，可使小鼠平均存活时间显著延长。两种疫苗的抗瘤效应无明显区别。结论来源于突变p53的抗原肽重组疫苗，可代替抗原大分子应用于肿瘤的免疫防治。

中图号:R730.51文献标识码：A文章编号：1007－8738(2000)03－0248－05

Comparison of antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 and its antigenic peptide

ZHANG Ke-qiangHOU Chun-meiYANG Jing-qingTANG Pei-xuanMAO Ning

（Institute of Basic Medical Sciences, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850,China）

Abstract:Aim To explore antitumor responses induced by recombinant vaccinia viruses expressing a point mutant p53 (rVV p53FL)and its antigenic peptide rVV p53M). Methods P815 mastocytoma transduced with a 135 Cys to Tyr point mutation p53 was used as an experimental tumor (P815 mp53) and the p53 protein as the model of tumor associated antigen. rVV p53FL and rVV p53M were used as tumor vaccine to investigate their induction of CTL and antitumor immunity. Results Immunizing Balb/c mice with rVV p53FL and rVV p53M could induce specific CTLs, which specifically lysed P815 mp53 cells. After the immunized mice were challenged with a lethal dose of P815 mp53, a part of the mice survived. The mice bearing tumor was treated with rVV p53FL and rVV p53M, which could significantly prolong the mice′ s survival time. Antitumor response induced by rVV p53M was comparable to that by rVV p53FL. Conclusion antigenic peptide derived from mutant p53 protein may replace the protein as vaccine for antitumor immunotherapy.

Keywords： p53； antigenic peptide； recombinant vaccinia virus ▲

癌基因和抑癌基因的改变是肿瘤细胞的一种共同现象，突变的癌基因和抑癌基因产物可成为免疫系统识别和攻击的靶分子。p53突变与多种肿瘤的发生和发展密切相关，是肿瘤易感基因之一^〔1〕。由于p53突变是人类肿瘤最常见的基因改变，因而成为靶向性肿瘤免疫治疗中极具吸引力的靶分子。

随着MHC分子识别和递呈抗原理论的突破，以及多个肿瘤抗原CTL所识别的抗原肽的证实，以抗原肽代替完整抗原大分子诱导抗原特异性的肿瘤主动免疫治疗已成为可能。将人工合成编码抗原肽的双链寡核苷酸微基因(minigene)，整合至痘苗病毒基因组中，构建的重组疫苗是代替人工合成抗原肽的一种有效的免疫方法^〔2〕。Yanuck等^〔3〕报道，来源于人肺癌p53蛋白包含135位Cys→Tyr的点突变肽p53125-145(TYSPALNKMFYQLAKTCPRQL),能够诱导H2d限制性CTL。我们在此基础上，选择该点突变p53蛋白为肿瘤相关抗原模型，建立了表达该蛋白的小鼠肿瘤细胞P815mp53，并比较了表达突变p53蛋白及其抗原肽重组疫苗诱导的抗肿瘤免疫应答。

1材料和方法

1.1材料X-gal和5-Br尿嘧啶脱氧核苷酸为Sigma公司产品。LipofectamineTMReagent和G148为GibcoBRL公司产品，鼠抗人p53单克隆抗体(mAb)DOII为SantCruz公司产品。pJSA1175:包含痘苗病毒基因组TK基因的左右两部分，并有极性向反的两个痘苗病毒基因的启动子(其中在

11kb启动子下游插入标记基因LacZ，7.5kb启动子下空载)，由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。pRC/CMVp53:含135位Cys→Tyr点突变的人p53基因，由美国Carbone博士惠赠〔3〕。肿瘤细胞P815(H2d)来源于DBA/2小鼠肥大瘤细胞系(本室保存)。人骨肉瘤TK－143细胞和野生型痘苗病毒中国天坛761株，由中国预防医学科学院病毒研究所阮力教授惠赠。Balb/c小鼠(H2d)，6～8wk龄，雌性，由本院动物中心提供。

1.2方法

1.2.1重组痘苗病毒的构建和鉴定①重组质粒的构建：依据抗原肽p53125145的氨基酸序列合成引物I：5′CCACCATGACGTACCCTGCCCTCAACAAG

ATGTTTTACCAACTGGCC3′和引物II：5′CTATCA

CAGCTGCACAGGTCAGGTCTTGGCCAGTTGGTAAA

ACATCTTG3′。引物I:5′端引入了Kozak序列CCACC，其后紧接起始密码子ATG；引物II：3′端加入双终止密码子TGATAG^〔4〕；划线部分为引物间碱基互补配对区。用PCR合成编码该肽的寡核苷酸minigene，克隆至pGEMT载体测序分析正确后，分别将minigene和点突变的p53基因的cDNA，插入质粒pJSA1175的7.5kb启动子下游构建重组质粒pJSA1175p53M与pJSA1175-p53。②重组痘苗病毒的构建：将TK^＋野生型痘苗病毒按0.1pfu(plaqueformingunite)/细胞感染TK－143细胞后，采用lipofectamine共转染法将重组质粒导入TK－143细胞，经同源重组获得重组痘苗病毒。在25mg/LBudr和200mg/LX-gal双重筛选下，获得蓝色重组痘苗病毒噬斑^〔5〕。挑取单个蓝斑，纯化3～5代至蓝斑纯度达100％，分别命名为rVV-p53FL和rVV-p53M。③Minigene整合与转录的检测：设计5′端引物：CCACCATGACGTACTCCCCTG和3′端引物：CAGCTGCACAGGGCAGGTCT，提取rVV-p53M基因组DNA与RNA。以PCR和RTPCR检测minigene的整合与转录。④rVV-p53FL的表达：以rVV-p53FL感染TK－143细胞48h后，提取细胞总蛋白。以野生型痘苗病毒感染的TK－143细胞作为阴性对照，用ECLWesternboltanalysissystem试剂盒进行p53蛋白的检测。

1.2.2肿瘤细胞系P815mp53的建立将质粒pRC/CMVp53采用lipofectamine共转染法导入P815细胞，以含600mg/LG418的培养液选择抗性克隆，并以免疫细胞化学染色法初检p53蛋白的表达，所获阳性克隆进一步用有限稀释法再克隆化培养，用Westernblot检测p53蛋白的表达。挑选p53表达高、全阳性的克隆作为表达突变p53蛋白的肿瘤细胞系P815mp53，置于含600mg/LG418的DMEM培养基中培养。

1.2.3CTL杀伤活性的测定①重组痘苗病毒的免疫接种及诱导CTL：取9只小鼠，随机分为3组，分别以1×10⁷pfuwtVV，1×10⁷pfurVV-p53M和1×107pfurVV-p53FL经静脉免疫4wk后，常规制备免疫鼠脾细胞悬液。取5～6×109/L脾细胞，分别与经80mg/L丝裂霉素C37℃处理45min的2～3×10⁹/L的P815-mp53细胞等体积混合，在含25×103U/LrhIL2,2×10³moL/LL谷氨酸、5×10⁵mol/Lβ巯基乙醇及100mL/L小牛血清的培养基中，于50mL/LCO₂条件下37℃培养5～6d，作为效应细胞^〔6〕。②杀伤试验：靶细胞P815-mp53和P815细胞为阴性对照。效应细胞：收获体外经刺激细胞刺激5d的脾细胞，用Ficoll(d=1.0717)离心，除去死细胞。将活细胞稀释成不同浓度接种于96孔U形底培养板(100μL/孔)。将100μL靶细胞(1×104)与效应细胞混合，形成不同的效靶比(E∶T)，同时做自然释放孔和最大释放孔。于37℃50mL/LCO₂条件下作用18h，离心取100μL上清，以乳酸脱氢酶法测定CTL的杀伤活性^〔7〕，在酶联仪上读取540/490nm处的A值，结果按以下公式计算:

③CTL的表型分析：以2mg/L的兔抗鼠抗CD4与CD8单克隆抗体(mAb)封闭CTL的杀伤活性，观察抗CD4与抗CD8mAb对CTL杀伤活性的影响。

1.2.4重组痘苗病毒在体内抗肿瘤的实验研究^〔8〕

①保护性实验:取21只小鼠，随机分为3组，分别以1×10⁷pfuwt-VV，1×10⁷pfurVV-p53M和1×10⁷pfurVV-p53FL于静脉免疫4wk后，经尾静脉接种致死剂量(1×10⁶)的P815-mp53细胞，观察各免疫组小鼠的存活时间和存活率。②治疗性实验:取21只小鼠，随机分为3组，先通过静脉接种致死剂量的P815-mp53细胞，分别在接种后的第3天和第6天，静注1×10⁷pfuwt-VV，1×10⁷pfurVV-p53M和1×10⁷pfurVV-p53FL免疫治疗各实验组小鼠，记录各免疫组小鼠的存活时间和存活率。

2结果

2.1Minigene整合与转录的检测Minigene经同源重组整合至痘苗病毒基因组后，可随病毒基因组一同复制、转录和翻译。然后，以PCR和RTPCR检测便可扩增出70bp的DNA条带。结果表明，目的基因已整合至痘苗病毒基因组并得到正确转录(图1)。