摘要：目的观察Fas基因转导人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR对化疗药物的敏感性，并初步探讨其机制。方法以流式细胞仪检测Fas基因转导和对照胃癌细胞在细胞周期中的分布；用MTT实验检查癌细胞对多种药物的敏感性；用免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞P糖蛋白(Pgp)和拓扑异构酶II(TopoII)的表达。结果与胃癌细胞SGC7901和pBKSGC7901/VCR相比较,FasSGC7901/VCR在G2期减少，S期增多，并出现明显的凋亡峰；FasSGC7901/VCR对DDP，MMC和5Fu的敏感性增加，但对VCR和DOX的敏感性无明显变化；SGC7901，pBKSGC7901/VCR和FasSGC7901/VCRTopoII的表达无明显差别；FasSGC7901/VCRPgp的表达水平明显低于pBKSGC7901/VCR，仅显示弱阳性。结论Fas基因可在一定程度上逆转人胃癌耐药细胞SGC7901/VCR的多药耐药性(MDR)，其涉及的相关机制可能是增强细胞对凋亡诱导剂的敏感性，以及降低细胞Pgp的表达水平。

中图号：R730.2文献标识码：A文章编号：1007－8738(2000)03－0260－04

Drug sensitizing effect and related mechanisms of Fas gene transduction on human drug resis tant gastric cancer cell SGC7901/VCR

YIN FangZHAO Wei-pingSHI Yong-quanXIAO BingMIAO Ji-yanFAN Dai-ming

（PLA Institute of Digestive Desease,Xijing Hospital,Fouth Military Medical University, Xi'an 710032,Shaanxi Province,China ）

Abstract： Aim To observe the drug sensitizing effect and related mechanisms of Fas gene transduction on human drug resistant gastric cancer cell SGC7901/VCR. Methods The cell cycle alteration， the sensitivity of gastric cancer cells to several anti tumor drugs and expression of P gp and Topo II in gastric cancer cells were detected by FCM, MTT assay and immunocytochemical staining,respectively. Results By comparing with SGC7901 and pBK SGC7901/VCR,Fas SGC7901/VCR cells decrease in the G2 stage and increase in the S stage, and obviously apoptotic peak arisen. Increased sensitivity of Fas SGC7901/VCR to DDP, MMC and 5 Fu;Topo II expression among SGC7901, pBK SGC7901/VCR and Fas SGC7901/VCR had no obvious differences;P gp expression level in pBK SGC7901/VCR was lower than that in SGC7901. Conclusion Fas gene transduction could reverse the multidrug resistance(MDR)of human drug resistant gastric cancer cell SGC7901/VCR, for which the higher sensitivity to apoptosis and decreased expression of P gp may be responsible.

Keywords: Fas gene； gastric cancer； multidrug resistance； gene transduction； apoptosis ▲

化疗是目前治疗肿瘤的主要途径之一。但由于肿瘤细胞可对抗癌药物产生多药耐药现象(MDR)，仍难达到满意的效果。近年研究表明，凋亡信息的抑制和细胞寿命的延长是产生多药耐药的机制之一^〔1〕，因此，拟提出通过诱导或促进癌细胞凋亡来逆转其耐药的表型。本文中我们观察了导入促进凋亡的Fas基因的胃癌耐药细胞SGC7901/VCR中目的基因的表达，并从P-糖蛋白(P-gp)和拓扑异构酶II(TopoII)的表达水平，探讨了Fas基因逆转胃癌细胞耐药的可能机制。

1材料和方法

1.1材料胃癌耐药细胞株SGC7901/VCR由本所保存。Fas基因真核表达载体pBKCMV/Fas,Fas基因和空载体分别转导的胃癌耐药细胞株(FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR)，由肖冰博士后构建。PMSF，Aprotinin，聚丙烯酰胺，ABC试剂盒，DAB显色液及DMSO等，购于华美生物工程公司和Promega公司。MTT和醋酸纤维素膜为Sigma公司产品。抗Fas,抗Pgp及抗TopoⅡ抗体均购于武汉博士德公司。阿霉素(DOX)为FarmitiliaCarloErbe公司产品。丝裂霉素C(MMC)为KyowaHakkoKogyo公司产品。长春新碱(VCR)为上海第十二制药厂产品。5氟尿嘧啶(5Fu)为上海旭东海普药业有限公司产品。顺铂(DDP)为山东齐鲁制药厂产品。

1.2方法

1.2.1耐药细胞Fas基因转导株的鉴定采用免疫印迹杂交分析。以三去污剂裂解细胞，制备Fas基因及空载体分别转导的FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR株的膜蛋白。一半经SDSPAGE分离蛋白；另一半做免疫印迹，以SDS变性NC膜后，常规显色。

1.2.2癌细胞对药物敏感性的检测(1)取对数生长中期的3种癌细胞(SGC7901，FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR)，接种于96孔板中(每孔5×103个/100μL)，置37℃培养12h。当细胞生长状态良好时，按正常血药浓度的0.1,1,10和100倍(或20倍)分别加入药物(DDP,MMC,VCR和5Fu)，每孔终体积为200μL。每种设3个复孔，并设不加药物的空白对照。继续培养72h后，每孔加入50g/LMTT20μL再培养4h。弃上清，加DMSO150μL/孔，轻振10min，用ELISA仪于490nm处测定每孔的吸收(A)值，并按下式计算不同药物浓度下癌细胞的存活率：

癌细胞存活率(％)=(实验孔A值/对照孔A值)×100％

1.2.3细胞周期测定将SGC7901，FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR常规传代培养。待细胞生长至对数中期，用胰酶(2.5g/L)消化并收集，盐水洗涤2次后，于4℃离心(800r/min)10min。取细胞，用700mL/L乙醇4℃固定过夜。测定前,再以盐水洗2次，用0.5mL碘化丙啶(PI)染色15min后，做流式细胞仪分析。

1.2.4Pgp和TopoII表达的检测制备培养的SGC7901，FasSGC7901/VCR和pBKSGC7901/VCR的爬片，并用冷丙酮固定。加3mL/L甲醇于室温封闭30min，PBS振洗3次×5min，再以含100mL/L山羊血清的PBS室温封闭30min，分别滴加1∶1000抗Pgp和抗TopoIImAb(对照组加适当稀释度的正常小鼠血清)，4℃过夜。再于37℃1h，PBS振洗3次×5min。依次滴加1∶50生物素化的抗小鼠IgG(37℃作用40min，同上振洗)，1∶50AB复合物(同上孵育、振洗)及DAB显色(室温避光10～15min)。再以苏木素复染、常规脱水、透明，中性树脂胶封片。

2结果

2.1Fas基因的表达Fas转导株与空载体转导株的SDSPAGE条带无显著差别。但免疫印迹显示，转导株在相对分子质量(Mr)为36000～40000处较空载体转导株多出现1条带，大小与Fas蛋白的Mr相符。转导株的转膜蛋白，在相应位置出现明显的印迹着色，而非转导株仅有微弱的表达(图1)。

图1Fas的SDSPAGE及免疫印记杂交分析

Fig 1 SDS PAGE and Weston blot of Fas in three kinds of cell lines A: SDS PAGE; B: Weston blot; 1, 4:Total protein (100 μ g)extracted from pBK SGC7901/VCR and Fas SGC7901/VCR respectively; 2,5: Total protein(150 μ g)extracted from pBK SGC7901/VCR and Fas SGC7901/VCR respectively; 3: Marker(Mr× 103).

2.2癌细胞对药物的敏感性与pBKSGC7901/VCR相比较，FasSGC7901/VCR对DDP，MMC和5Fu的敏感性明显增加(P≤O.O5，图2)，而对VCR和DOX的敏感性无明显变化(P≥0.05)。

2.3细胞周期的分析FasSGC7901/VCR在G1/

0,G2,S期的比例分别为：0.70，0.06和0.24；pBKSGC7901/VCR分别为：0.67,0.17和0.13。3种细胞在G1期的比例无明显差异，但Fas-SGC7901/VCR在S期的分布增多，为pBK-SGC7901/VCR的1.9倍；G2期减少，为pBK-SGC7901/VCR的0.33倍；并出现明显的凋亡峰(凋亡细胞为7.7％)。

2.4Fas对耐药细胞表达P-gp和TopoII的影响

pBK-SGC7901/VCR和SGC7901均表达P-gp，但前者明显强于后者；而FasSGC7901/VCR对P-gp的表达明显减弱或不表达(图3)。3种癌细胞对TopoII的表达呈中等水平。

图23种癌细胞经不同剂量的化疗药物处理后的存活率(％)

Fig 2 Survival rates of three kinds of cancer cells treated with chemotherapeutic drugs (％ ) aP∨ 0.05 vs Fas SGC7901/VCR.

图3免疫细胞化学染色检测3种癌细胞中P-gp的表达

Fig 3 P gp expression in the 3 tumor cells lines by immunocytochemical staining(× 400) A: pBK SGC7901/VCR; B: SGC7901; C: Fas- SGC7901/VCR.

3讨论

Fas基因在肿瘤细胞的凋亡中具有重要作用。细胞膜表面的Fas分子与FasL或其抗体结合后，可向细胞内传递死亡信号，在数小时内死亡。但癌细胞Fas的表达水平异常低下，发生转移的癌组织几乎不表达。Fas在胃癌及