摘要：目的探讨赋予肝癌细胞第二信号分子B7.1、增强癌细胞与淋巴细胞之间的识别与激活作用，从而达到增强淋巴细胞对肝癌细胞的杀伤或抑制作用。方法利用逆转录方法，转染B7.1分子至包装细胞系PA317。筛选获得高滴度的克隆后，以病毒上清感染肝癌细胞，使其表达B7.1分子，最后以LDH释放法测定LAK细胞的细胞毒活性。结果肝癌细胞可稳定表达B7.1分子，阳性率达94.3％，未转染的细胞无表达；其所诱发的LAK细胞的细胞毒活性明显强于未转染的肝癌细胞组(P∨0.01)。结论B7.1分子在淋巴细胞与癌细胞之间的识别过程中起着重要作用，可介导淋巴细胞对癌细胞的粘附和识别，从而增强淋巴细胞的杀伤作用。这一结果可为今后进一步深入研究B7.1的作用机制，以及与其它细胞因子、粘附分子的相互作用打下基础。

中图号：R735.7R392.12文献标识码：A

文章编号：1007－8738(2000)02－0148－04

Pilot study of immunoreactivity on B7.1 gene transfecting hepatocarcinoma cells

LI Zeng- shanSUI Yan- fangYE Jing， GUO Ai- lin

（Department of Pathology， the Fourth MilitaryMedical University， Xi'an 710032, Shaanxi Province， China ）

Abstract： Aim To study costimulation mediated by costimulatory molecules, B7- 1, counter- receptor ligands forthe CD28/cytolytic T lymphocyte associated antigen(CTLA)- 4, which plays an important role in the induction of Tcell- mediated antitumor immunity against HCC. Methods Retroviral transduction was applied in transfectingpLXSN- B7.1 into packaging cell line,PA317, and high- titer clone was acquired. Then the virus stock were used toinfect the HHCC cell lines and the clone strongly expressing B7.1 was picked out. At last the primary LAK cytotoxicitywere processed through the method of LDH release. Results After transfection, HHCC cell line could express B7.1steadily. The introduction of B7.1 into HHCC cells in vitro induced a strong immunity that was associated with LAKcells in contrast to the untransfected cells in which B7.1 was not expressed (P∨ 0.01). Conclusion Our findingssuggest that B7- 1 gene transfer is an appropriate way to induce strong expression of this molecule and enhance therecognition by LAK cells. This might be useful for studying the B7.1 molecular more thoroughly and for immuno-gene therapy against human HCC.

Keywords: HCC； B7.1； costimulation

肿瘤细胞的杀伤主要依赖于T细胞的激活，目前的研究表明，T细胞的激活依赖于两方面的刺激:①通过TCR介导的抗原特异性刺激；②通过抗原提呈细胞传送的非抗原特异性第二信号的刺激。如果第二信号缺失，会导致T细胞克隆的无反应性或凋亡^[1,2]。B7.1（CD80）是目前研究最为广泛的共刺激信号分子。已有一些研究表明，转染B7.1基因的肿瘤细胞可对CD^8＋T或CD^4＋T细胞产生直接共刺激作用，而导致肿瘤细胞被杀伤或抑制^[3－5]，但肝癌细胞B7.1基因的表达多低下或缺如，成为肝癌细胞逃逸免疫排斥反应的一个重要原因^[6]。在上述理论的基础上，我们将B7.1基因通过包装成逆转录病毒的方法，转染至肝癌细胞系（HHCC），以增强其刺激T淋巴细胞时的第二信号，为 改进肝癌免疫基因的治疗提供实验依据。

1材料和方法

1.1材料逆转录病毒载体pLXSN-B7由本室保存。逆转录病毒包装细胞系PA317，为本校唐都医院骨肿瘤实验室张惠中博士惠赠。肝癌细胞系HHCC由本室保存。上述细胞均在含100mL/L新生牛血清的DMEM（高糖）培养基，37℃50mL/LCO₂条件下培养。

1.2方法

1.2.1逆转录病毒的包装及转导质粒pLXSN－B7经脂质体lipofectamine（Gibco）介导转染至病毒包装细胞系PA317中，经G418（500mg/L）筛选出阳性转染细胞，克隆化得到单克隆。取每个克隆的培养上清5mL（约含逆转录病毒2～3μg)感染PA317细胞，并进行滴度测定。测定滴度前1d，将待测细胞NIH3T3做1∶10稀释后接种。测定滴度的当天，将待测NIH3T3细胞的培养基更换为PA317细胞的培养上清，感染时间为2h。然后更换为正常培养基，培养48～72h后，取1/15接种于两个8cm的平板，更换成选择培养基（G4181g/L），每4d更换液体1次。到第11～12天，计数平板上的克隆，得到高滴度克隆后，按下列公式测定滴度：

G418-R(10³cfu/L)=克隆数/病毒上清量(L)×细胞复制周期数

×NIH3T3细胞稀释倍数

取高滴度克隆的培养上清5mL（约含病毒0.1～0.01mg/L）转导肝癌细胞，方法同滴度的测定。转导后的肝癌细胞经克隆 化筛选出单克隆。

1.2.2阳性克隆的筛选将经感染后筛选出的单克隆扩大培养后做FCM检测，确定阳性克隆。小鼠抗人CD80mAb（1∶100稀释）和FITC-羊抗鼠IgG/M（1∶100稀释），均为PharMingen公司的产品（购自晶美公司）。阳性对照抗体用肝癌特异性mAbHAb18(本校863 课题组提供),阴性对照为不加一抗。

1.2.3LAK细胞的诱导及细胞毒活性的测定①LAK细胞的诱导:取肝癌患者外周血常规分离淋巴细胞，置入含200mL/L新生牛血清的DMEM中培养，并加PHA(10mg/L)和IL-2(1×10⁵U/L)（华美公司产品）。扩大培养后，调整细胞密度为4×10⁷/L，于6孔板中每孔加入淋巴细胞2.5×10^－3/L及丝裂霉素灭活的肿瘤细胞1mL(1×10⁷/L)，培养5d。②LAK细胞的细胞毒活性测定^〔7〕：采用LDH释放法。同时，测定转染B7.1基因前后的HHCC细胞，效靶比(E/T)分别为100∶1，25∶1及1∶1。培养6h后，用全自动生化分析仪(Beckman公司产品)测定LDH活性（1×10³IU/L），并按下 列公式计算LAK细胞的杀伤活性。

统计学处理：采用SSPS软件对所得资料进行t检验。

2结果

2.1pLXSN-B7的包装及滴度测定PA317细胞经pLXSN-B7转染并克隆化，挑选出21个单克隆，依次编号为：pb1，2，3……21。滴度测定表明，pb4和pb17为阳性克隆，滴度分别约为2.5×10⁷～2.5×10⁸cfu/L和2.3×10⁴～2.3×10⁵cfu/L，遂确定pb4为以下实验所用 的pLXSN-B7转染的阳性细胞。

2.2B7.1基因的表达将pb4培养上清感染的肝癌细胞株HHCC，经G418筛选并克隆化，得到12个单克隆，依次命名为HHCC-PB-1，2，3……12。经流式细胞仪检测确定，HHCC-PB-2，3，5，7和

9号为表达B7.1基因的阳性克隆，其中HHCC-PB-2号的阳性细胞率达94.3％，未转染的细胞无B7.1基因的表达（图1）。

图1B7.1基因表达的FCM分析

Fig1Flow cytometric analysis of B7.1 gene expression

2.3LAK细胞的细胞毒试验将肝癌细胞与肝癌患者的外周血淋巴细胞混合后，可有效地刺激淋巴细胞增殖。经IL-2刺激后所获肿瘤特异性LAK细胞，以100∶1，25∶1和1∶1的效靶比，与转染B7.1基因前后的HHCC混合培养。混合后4h，开始出现明显的杀伤作用；6h后镜下可见表达B7.1的肝癌细胞大部分被杀死， 死亡的癌细胞从培养瓶壁上脱落，聚集成团，与淋巴细胞混合在一起。死亡细胞的形态大致呈圆形，但胞膜极不规则，胞浆浓缩，胞核色深，尚可见大量细胞碎片(图2)。我们还观察到，效靶细胞相互作用的动态过程，即部分淋巴细胞逐渐趋向癌细胞，随后两者的胞膜接触，癌细胞的膜发生变形，呈从瓶壁上脱落的趋势。未转染的细胞也有部分被杀死，并且少量细胞出现分裂像。混合培养6h后，以所测定的LDH的释放量(10³IU/L）计算杀伤率，结果如图3。在3个试验组中，转染B7.1基因的HHCC细胞的杀伤率分别为43.2％，84.4％和89.2％，均高于未转染的HHCC细胞（P＜0.01）。

图2LAK细胞对转染B7.1基因前后HHCC细胞的杀伤活性

Fig2Cytotoxicity of LAK cells on HHCC and HHCC-B7.1cells

A：B7.1-HHCC cells cocultured with LAK cells for6h(×40);B：B7.1^＋HHCC

cells cocultured with LAK cells for 6h(×40).

图3LAK细胞对HHCC