摘要：目的研究白介素-1(IL-1)受体相关激酸-2（IRAK-2）在IL-1诱导NF-κB活化中的作用。方法分别以逆转录PCR法和Western杂交法，检测lipofectin介导的反义IRAK-2寡核苷酸转染的人脐静脉内皮细胞中，IRAK-2mRNA和蛋白表达水平。用夹心ELISA法检测NF-κB的活化。结果反义IRAK-2寡核苷酸可阻断IRAK-2mRNA的翻译，从而抑制IRAK-2蛋白的表达，抑制率达45％；反义IRAK-2寡核苷酸抑制IL-1诱导的NF-κB活化，具有剂

量和时间依赖性，3μg与8h时的抑制效果最好。结论IRAK-2 可调控IL-1诱导的NF-κB活化。

中图号：R392.11文献标识码：A

文章编号：1007－8738(2000)02－0128－03

Role of IL-1 receptor associated kinase-2 in IL-1 induced NF-κ B activation

GUO Fu- kunLI Yi- leiWU Shu- guang

（Institute of Pharmaceutic Sciences,First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province,China）

Abstract:Aim To investigate the role of interleukin-1(IL-1) receptor associated kinase-2(IRAK-2) in IL 1 induced nuclear factor-κ B(NF-κ B) activation. Methods Antisense phosphorothioate oligonucleotide(ODN) was designed to sequences of IRAK- 2. Antisense IRAK-2 ODN was delivered by lipofectin encapsulation into cultured endothelial cells. IRAK-2 mRNA and protein expression were detected by semiquantitative reverse transcription-PCR and Western blot, respectively. The level of NF κ B as measured by sandwich ELISA. Results Antisense IRAK- 2 ODN blocked IRAK-2 mRNA translation and protein expression was inhibited. As a result, antisenseIRAK-2 ODN inhibited IL-1 induced NF-κ B activation in a dose(1 4 μ g)- and time(5 24 h)-dependent manner. When the cells were treated with 3 μ g of antisense IRAK-2 ODN for 8 h, a maximum inhibition

was achieved. Conclusion IRAK-2 might be necessary for IL-1- stimulated NF- κ B activation.

Keywords:interleukin-1; interleukin-1 receptor associated kinase-2; antisense oligonucleotide; nuclear factor-κB

白介素-1(IL-1)是在免疫和炎症反应中起核心作用的细胞因子^〔1〕。越来越多的研究证明，NF-κB可调控IL-1刺激的炎症因子表达^〔2，3〕。因此，阐明IL-1激活NF-κB的机制显得尤为重要。最近发现，IL-1受体相关激酶(IRAK)家族的成员IRAK-2，转染人胚肾293细胞可引起NF-κB活化；而以IRAK-2缺失突变体转染细胞后，则NF-κB活性明显降低^〔4〕。这种从IRAK－2的异位表达研究中所观察到的现象，提示IRAK-2可能参与了调控NF-κB的活化。为确证IRAK-2对IL-1诱导NF-κB活化的调节作用，我们通过反义IRAK-2寡核苷酸抑制内皮细胞中IRAK-2的表达，观察了IL-1诱导的NF-κB的活化情况。

1材料和方法

1.1材料DMEM和lipofectin从GibcoBRL公司购买。IL-1β由北京邦定生物医学公司提供。山羊抗NF-κBp65亚基特异性抗体(其识别的抗原表位存在于人源NF-κBp65亚基羧基末端)和兔抗NF

-кBp65亚基的特异性抗体(其识别的抗原表位存在于人源NF-кB p65亚基氨基末端)，为美国SantaCruz生物技术公司产品。HRP标记的羊抗兔IgG购于河南华美生物工程公司。SV总RNA分离试剂盒和逆转录－PCR(RT-PCR)试剂盒，为Prom-ega公司产品。兔抗IRAK-2的特异性抗体，由美国MartaMuzio博士惠赠。人脐静脉内皮细胞的分离培养^〔5〕：脐静脉用PBS冲洗数次(尽可能洗去红细胞)，灌入2.5g/L胰酶消化10min分离细胞，以1000r/min离心7min后，用含200mL/L胎牛血清的DMEM重悬，接种于6孔培养板中，于37℃50mL/LCO2条件下培养1d后，更换培养基，以后每2d换液1次，至细胞长满皿底。反义IRAK-2寡核苷酸的序列：反义IRAK-2ODN及正义IRAK-2ODN由上海生工生物工程有限公司合成。ODN5′端和3′端的3个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。正义ODN的序列为：5′-ATGGCCTGCTACA-TCTAC-3′与靶序列一致；反义ODN的序列为：5′-GTAGATGTAGCAGGCCAT-3′，与靶序列相互补。Lipofectin包裹寡核苷酸的制备，参照lipofectin的说明书进行。

1.2方法

1.2.1IRAK-2mRNA水平的测定汇合成片的细胞用IL-1β(looku/L)刺激30min，洗去IL-1β，加入lipofectin包裹的IRAK-2寡核苷酸3μg孵育8h，洗去寡核苷酸，提取细胞总RNA。IRAK-2mRNA经RT-PCR扩增后，以15g/L琼脂糖凝胶进行电泳，并用GelBASE/GelBLOT/GelExcel/GelSequence图象分析软件(UVP公司产品)定量，重复实验3次。IRAK-2的5′端引物为：5-CTGAGGATGAACAGGAAGAGG-3′；3′端引物为：5′-CCAGCACAGGTAAGACATTGG-3′。内参照β-ac-tin的5′端引物为：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′；3′端引物为:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(由上海生工生物工程有 限公司合成)。

1.2.2Western印迹杂交分析IRAK-2的表达汇合成片的细胞用IL-1β(100kU/L)刺激30min。洗去IL-1β后，加入lipofectin包裹的IRAK-2寡核苷酸3μg孵育8h，洗去寡核苷酸，进行Western印迹杂交^〔6〕，并用GelBASE/GelBLOT/GelExcel/GelSequence图象分析软件(UVP公司)定量，重复实验3次。

1.2.3夹心ELISA法测定NF-κB汇合成片的细胞用IL-1β(100kU/L)刺激30min。洗去IL-1β后，分别加入lipofectin包裹的反义IRAK-2寡核苷酸(1,2,3,4μg)孵育8h，或加入lipofectin包裹的抑制作用最强（图3）．反义IRAK-2寡核苷酸3μg分别孵育5,8,24h。洗去反义寡核苷酸，用IL-1β刺激1h。实验中同时设立基础组(细胞不经IL-1和反义IRAK-2寡核苷酸处理)和阴性对照组(细胞只用IL-1刺激而不转染反义IRAK-2寡核苷酸)。然后，按Rovin等^〔3〕的方法提取细胞核蛋白，用夹心ELISA法^〔7〕测定NF-κB，重复实验3次。数据处理：实验数据以±s表示，采用t检验 进行统计学分析。

2结果

2.1反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2mRNA翻译的阻断作用通过IRAK-2的PCR产物与作为内参照的看家基因β-actin的PCR产物吸收峰下面积的比值，来反映反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2mRNA表达的影响。结果表明，反义IRAK-2寡核苷酸可显著阻断IRAK-2mRNA的翻译(P＜0.05)；而正义IRAK-2寡核苷酸则不能阻断 IRAK-2mRNA的翻译(图1)。

图1反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2mRNA表达的阻断作用

Fig1Blocking effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 mRNA expression

M:DNA size marker;S:Sense IRAK-2 ODN；AS:Antisense IRAK-2 ODN;

C:Control;AUP:Area under peak.

2.2反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2蛋白表达的抑制作用Western印迹杂交分析结果显示，反义IRAK-2寡核苷酸可抑制IRAK-2蛋白的表达，抑制率达45％；而正义IRAK-2寡核苷酸则无抑制 作用(图2)。

图2反义IRAK-2寡核苷酸对IRAK-2蛋白表达的抑制作用

Fig2Inhibitory effect of antisense IRAK-2 ODN on IRAK-2 expression

S:Sense IRAK-2 ODN;AS:Antisense IRAK-2 ODN;C:Control.

2.3反义IRAK-2寡核苷酸抑制IL-1诱导的NF-κB活化未经IL-1刺激的基础组，内皮细胞有低水平的NF-κB活化，波长450nm的吸光度值(A₄₅₀)为0.247±0.026；用IL-1刺激细胞时，NF-кB的A₄₅₀值升高至1.289±0.035，说明IL-1可诱导NF-κB活化。内皮细胞经反义IRAK-2寡核苷酸处理后，IL-1诱导的NF-κB活化可受到明显的抑制(P＜0.01)；且抑制作用具有剂量和时间依赖性，以3μg的反义IRAK-2 寡核苷酸与细胞孵育8h

图3反义IRAK-2寡核苷酸对IL-1诱导的NF-κB活化的抑制作用

Fig3Inhibitory effect of antisense IRAK-2 ODN on

IL-1induced NF-кB activation

3讨论

反义寡核苷酸可特异性抑制靶基因的翻译，因而其不但具有潜在的临床应用价值，而且在理论研究上也有重要的意义。本研究结果表明，反义IRAK-2寡核苷酸可阻断IRAK-2mRNA的翻译，而对看家基因β-actinmRNA的翻译则无阻断作用(图1)，证明反义IRAK-2寡核苷酸的作用是特异性的。进一步研究发现，反义IR