摘要：目的观察IFN-γ能否在正常皮肤诱导表达银屑病皮损的病理表型，以及这一过程中IFN-γ和表皮内源性白细胞介素-1(IL-1)系统的相互影响。方法采用跨膜器官培养和

多种细胞因子刺激培养的皮肤，用免疫染色方法分析比较一系列代表银屑病免疫病理特征的多种蛋白分子的表达情况。结果IFN－γ可诱导培养的正常皮肤表达角蛋白17，I型转谷酰

胺酶(transglutaminasetypeI)，细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和HLA-DR。IL-1受体拮抗剂(IL-lra)或抗IL-1抗体，均可显著抑制IFN－γ诱导的角蛋白17和I型转谷酰胺酶表达，而对IFN-γ诱导ICAM-1和HLA-DR的表达则无抑制作用。结论IFN－γ可诱导人正常皮肤表达银屑病皮损的免疫病理表型，其中对角蛋白17和I型转谷酰胺酶的表达可通过表皮IL-1系统发挥影响。这项研究揭示，Th1型细胞因子(IFN-γ)和表皮IL-1系统在银屑病皮损形成 中具有内在的联系。

中图号：R758.63文献标识码：A

文章编号：1007－8738(2000)02－0142－04

Role of IFN- γ induction of psoriatic phenotype expression in cultured normal human skin

LIU WeiZHAO Qing- liZHANG Xin- huaCAI Rui- kang

（Department of Dermatology, Chinese PLA General Hospital of Air Force, Beijing 100036, China）

Abstract: Aim The biological role of IFN-γ in the induction of the psoriatic phenotype expression and its interaction with

epidermal IL-1 system was investigated in a skin organ culture model. Methods The tissue biopsies from healthy human skin were cultured for 24 hours and stimulated with IFN-γ , IL- 1 receptor antagonist(IL- lra),IFN-γ plus IL-1ra or anti IL- 1 antibodies. The induction of the epidermal psoriatic phenotype expression was analysed by immunostaining (APAAP). Results In the presence of IFN-γ , a strong upregulation of keratin 17 and transglutaminase type I(Tg type I) was found in the suprabasal layers of cultured normal skin. The ICAM-1 and HLA- DR were expressed on basal and suprabasal keratinocytes. Addition of IL- 1ra or anti- IL- 1 polyclonal antibodies into the IFN-γ con- taining medium could selectively block the effects of IFN- γ on the expressions of keratin 17 and transglutaminase type I, but no effects on IFN-γ induced expressions of ICAM- 1 and HLA- DR were discovered. Conclusion IFN-γ is able to induce an immunopathologic phenotype of psoriasis in cultured normal human skin and this induction is partially via the epidermal IL- 1 system. Above results suggested that there is an important intrinsic connection between Th1 cytokines and he IL- 1 system, and they were two crucial factors in the pathogenesis of psoriasis.

Keywords: psoriasis; interferon-γ ; interleukin- 1; skin organ culture

近年研究表明，Th1型细胞因子(IFN-γ,IL-2等)和IL-1系统在银屑病的发病机制中具有关键作用^〔1，2〕。但两类细胞因子在银屑病皮损形成和发展中如何相互影响，文献中报道甚少。我们采用皮肤器官培养结合细胞因子刺激技术，研究了这一问题，目的在于观察IFN-γ能否诱导正常皮肤表达银屑病皮损的表型，以及在这一过程中IFN-γ和表皮IL-1系统的内 在联系。

1材料和方法

1.1材料正常人皮肤标本12例，均来自创伤外科患者胸腹部手术的供皮，女7例，男5例，年龄20～51岁，全部供皮者均无皮肤疾患。取材时，使用3mm打孔器(Stiefel GmbH，德国)，以保证全部皮肤标本块大小均一。取材后，每例供皮者取其一块皮肤标本，置－80℃用作培养前的对照，其余标本做下列培养。

1.2方法跨膜皮肤培养装置为夹层12孔培养板，内层底部为一层74μm微孔膜(Netwell,Costar,美国)。培养皮肤时，需在微孔膜的中间打1孔，直立放入皮肤标本，使表皮位于膜上空气中，真皮浸于膜下液体中，即所谓液气相界面培养^〔3〕。培养液为含10mL/L人血清和青链霉素的IMDM，每孔1mL。培养条件如下：①培养液单纯培养；②于培养液中加入重组人IFN-γ250 U(Boehringer,德国)；③培养液中加入重组人IL-1受体拮抗剂(IL-lra)1μg（Synergen，美国）；④培养液中同时加入IFN-γ250U和IL-lra1μg；⑤培养液中同时加入IFN-γ250U和1∶5000的羊抗人IL-1α和羊抗人IL-1β抗体(S76,S77,均来自Glaxo,瑞士)。于37℃，50mL/LCO₂培养24h，收集皮肤标本，用OCT包埋，液氮速冻，制备6μm冰冻切片做免疫染色和分析。免疫染色分析采用APAAP法。试剂盒购自美国Zymed公司。一抗均为单克隆抗体(mAb)，分别为：鼠抗人角蛋白16(Sigma,美国)、鼠抗人角蛋白17mAb(Dako，美国)、鼠抗人I型转谷酰胺酶mAb(BTI，美国)、鼠抗人ICAM-1mAb(BBT,英国)及鼠抗人HLA-DRmAb(Becton Dickinson，美国)。阴性对照分别用下列试剂代替一抗：一抗的稀释液、正常小鼠IgG(Becton Dickinson,美国)和无关的小鼠mAbM203(CLB，荷兰)。阳性对照由银屑病皮损的冰冻切片代替待测培养标本的切片进行染色。染色结果参考文献〔2〕的方法，用半定量评分标准进行判定：“0”：阴性；“1”：弱阳性；“2”：阳性；“3”：强阳性。

统计学处理:采用秩和检验法，同一来源的皮肤标本经不同培养后，其结果比较按配对设计的资料处理。

2结果

标本在跨膜培养系统中培养24h后，用HE染色显示，所培养的皮肤标本可保持完整的组织形态和结构。免疫染色发现，培养基中单纯培养24h，正常皮肤表皮棘细胞层中角蛋白16、17无明显表达或仅在颗粒层下呈微弱阳性(图1A)。单纯培养后，I型转谷酰胺酶在正常皮肤的表达和培养前基本相同，即仅在颗粒层呈线状阳性，棘细胞层呈阴性(图2A)。单纯培养前后，ICAM-1在正常的皮肤不表达(图3A)，HLA-DR染色仅限于少数树枝状细胞呈阳性。而在培养基中加入IFN-γ刺激培养后，角蛋白17和I型转谷酰胺酶在正常皮肤棘细胞层均有强表达，染色呈强阳性(图1A和图2B)。角蛋白16的染色和单纯培养相比较，则无明显变化；ICAM-1和HLA-DR在IFN-γ的诱导刺激下，正常皮肤基底层和基底上层出现阳性(图3B)。上述结果表明，IFN-γ在皮肤器官培养条件下，可诱导表达一 系列与银屑病皮损相关蛋白分子(图4)。

图1角蛋白17在正常皮肤组织中的表达

Fig1Expression of keratin 17 in normal skin tissue(APAAP×82.5)

A:Cultured in medium as control;B:Cultured in medium with IFN-γstimulation.

图2I型转谷酰胺酶在正常皮肤组织中的分布

Fig2Distribution of transglutaminase type I in normal skin tissues(APAAP ×82.5)

A:Cultured in medium as control;B:Cultured in medium with IFN-γ stimulation.

图3正常皮肤组织中ICAM-1的免疫组化染色

Fig3Immunohistochemical staining of ICAM-1 in normal skin tissues(APAAP ×82.5)

A:Cultured in medium as control;b:Cultured in medinm with IFN-γstimulation.

图4在跨膜皮肤器官培养模型中IFN-γ诱导正常皮肤表达

一系列银屑病相关的蛋白分子

Fig4The expression of psoriasis-related markers in normal skin induced

by IFN-γ in transmembrane organ culture model

The data represent semiquantitative scores of the immunostaining(±s)

described in material and methods.^aP＜0.05,^bP＜0.01,

all vs medium control.t=0:Prior to culture.

分析IFN-γ和IL-1ra联合培养的染色结果发现，IL-1ra可显著抑制IFN-γ诱导的正常皮肤表达角蛋白17和I型转谷酰胺酶，而对IFN-γ诱导的ICAM-1和HLA-DR的表达则无明显影响(图5)。抗IL-1抗体也可选择性地阻断IFN-γ诱导正常皮肤表达角蛋白17和TGK，而不<