摘要：目的构建IFN-α/HBVPreS2融合基因表达载体并进行表达。方法采用PCR技术分别扩增IFN-α2b和HBVPreS2编码基因片段，并经分步克隆获得IFN-α/HBVPreS2融合基因。然后将其插入质粒pBV220，构建重组表达载体pBV-IFN-PreS2。结果经转化E.coli后，诱导表达出相对分子质量(Mr)为27000的融合蛋白。SDS-PAGE分析显示，表达量占菌体总蛋白质的15％。Westemblot分析表明，表达蛋白能与抗IFN-α2b抗体结合。结论IFN-α/HBVPreS2融合基因表达载体的构建，为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据。

中图号：R392.11

文献标识码：A

文章编号：1007－8738(2000)02－0103－03

Construction and expression of a recombinant expresson vector for IFN- α 2b/HBV Pre S2 fusion gene

XU Dong- ping

（1Department ofBiological Engineering）

WANG Fu- sheng

（1Department ofBiological Engineering）

（1Department ofBiological Engineering）

SHI Hong

（1Department ofBiological Engineering）

HAN Feng- lian

（1Department ofBiological Engineering）

CHENG Yun

（Department of Immunology, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China）

JIN Lei

（1Department ofBiological Engineering）

abstract: Aim To construct and express a recombinant expression vector bearing IFN- α 2b/HBV pre S2 fusiongene. Methods Through PCR and recombinant DNA techniques, the full length of cDNA encoding human IFN- α 2band HBV Pre S2 were respectively amplified and then together cloned into vector pBV220 in fusion form. Thus, arecombinant vector pBV- IFN- Pre S2 expressing human IFN- α 2b and HBV Pre S2 was successfullconstructed. Results After temperature induction, a fusion protein with relative molecule mass(Mr) of 27 000 wasexpressed, representing 15％ of total bacterial protein in E.coli. Western blot analysis showed the protein could bebinded with anti- IFN- α 2b antibody. Conclusion The successful construction of the vector might provide anexperimental basis for specific immunotherapy for HBV infection.

Keywords: HBV Pre S2; interfcron- α ; fusion protein

目前，针对乙型肝炎的抗病毒治疗药物中IFN-α仍为临床上首选药物，但其疗效不够理想。提高IFN-α疗效的一个思路是在IFN-α分子中连接上抗体或配体分子，以使药物的作用具有靶向性，从而提高其在局部的浓度。HBVPreS2基因编码蛋白含55个氨基酸残基，具有多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R)活性。在PHSA介导下，HBV可与人肝细胞表面的PHSA-R结合，为HBV感染具有嗜肝性的重要机制之一^〔1，2〕。将HBVPreS2基因与IFN-α基因融合后表达的融合蛋白，若能保持二者的生物学活性，就有可能通过PHSA-R的结合作用将融合分子导向肝细胞，达到靶向给药的目的。此外，IFN-α为一种多功能的免疫调节因子，与HBVPreS2的融合表达产物有可能增强PreS2抗原递呈的效能，增强机体对HBV的免疫应答。我们采用基因重组技术，构建了IFN-α/HBVPreS2融合基因表达载体pBV-IFN-PreS2，并在E.coli中表达了IFN-PreS2融合蛋白。

1材料和方法

1.1材料含有头尾相连HBV ayw全长DNA双体的pCP10质粒，E.coli表达载体pBV220和DH-5α菌株，均由军事医学科学院逯好英教授提供。含有人IFN-α2b编码基因的pB-IFN质粒由本室构建。pGEM3Zf(－)质粒购自华美公司。工具酶购自美国Promega公司和华美公司。PCR产物纯化试剂盒为美国Clontech公司产品。抗人IFN-α 2bHRP标记物为邦定医学生物公司产品。转膜用硝酸纤维素滤膜为美国Schlcher ＆ Schuell公司产品。PCR引物由 上海生物工程公司合成。

1.2方法

1.2.1重组质粒的构建利用设计的两对引物，分别从质粒 模板中扩增498bp的IFN-α 2b编码基因片段(引物P1＋P2扩增pB-IFN)和165 bp的HBVPreS2基因片段(引物P3＋P4扩增pCP10)，引物的序列如下：

P1：5′-GGAATTCATGTGTGACCTGCCGCA-3′;

P2:5′-GGGGATCCTGGGCTTTCTTTAGAACGCAGA-3′;

P3:5′-CGGGATCCATGCAGTGGAATTCCA-3′;

P4:5′-GCGTCGACTTAGTTCAGCGCAGGGTC-3′.

采用分步克隆法，即先将IFN-α 2b编码基因克隆入载体pGEM3Zf(－)，再利用基因间连接序列上设计的BamHI位点，将HBV Pre S2基因连接到IFN-α 2b基因的3′末端，转化JM109菌，获得含有融合基因的pGEM-IFN-PreS2克隆。连接序列为AGCCCAGGATCC，编码丝氨酸－脯氨酸－甘氨酸－丝氨酸。提取重组质粒，用EcoR I＋Sal I双酶切获取690bp的融合基因片段，与用相同酶切处理的载体pBV220连接，转化DH-5α宿主菌，获得pBV-IFN-PreS2表达克隆。然后，对重组质粒进行酶切和DNA序列的 分析鉴定(图1)。

图1融合干扰素基因重组质粒的构建

Fig1Construction of expression plasmid pBV-IFN-PreS2

1.2.2融合蛋白的表达挑取pBV-IFN-PreS2表达克隆单菌落，接种于LB培养基进行一级扩增。扩增产物以1∶5接种于M9CA培养基，在30℃振荡培养6～7h后，升温至42℃诱导表达4h，离心收集菌体。菌体经溶菌酶和DNaseI酶处理后，置冰浴进行超声粉碎。粉碎液经4℃离心(12000r/min)15min，收集沉淀即为粗制包 涵体。

1.2.3Westernblot参照文献〔3〕的方法进行电泳和转膜，所用滤膜为0.45μm孔径的硝酸纤维素滤膜，用抗IFN-α mAb-HRP 进行检测。

2结果

2.1融合基因的构建经酶切和DNA序列分析证实，构建的融合基因同预期的结果完全相符。融合基因的DNA序列测定结果 见图2。

图2人IFN-α2b/HBV Pre S2融合基因的序列

Fig2Sequence of human IFN-α2b/HBV PreS2 fusion gene

====Linkingsequencebetweentwogenes;

GAA TTCEcoR I site;GTC GACsal I site.

2.2融合蛋白的表达重组人IFN-α 2b分子由166个氨基酸残基组成，相对分子质量(Mr)为19000；HBV Pre S2分子由55个氨基酸残基组成，加上连接序列编码的4个氨基酸残基，融合基因编码的IFN-PreS2融合蛋白共含225个氨基酸残基，推测其Mr为25000～27000。SDS-PAGE分析表明，pBV-IFN-PreS2转化菌经温度诱导后，在Mr27000处有1条明显的表达带，其Mr的大小与推测的融合蛋白的Mr相一致。表达量占菌体总蛋白的15％。离心后收集的粗制包涵体中，目的蛋白的含量达到总蛋白的70％以上。SDS-PAGE的结果见图3，所用聚 丙烯酰胺凝胶的质量浓度为120g/L。

图3融合蛋白的SDS-PAGE鉴定

Fig3SDS-PAGE analysis for IFN-Pre S2 fusion protein

1:Marker(Mr);2:rhIFN-α;3:Inclusion body;

4:Lysate of induced bac teria；5:Lysate of uninduced bacteria.

2.3Westernblot表达蛋白按照常规的方法经SDS-PAGE后，再电泳转膜，用抗IFN-α mAb-HRP检测，在Mr27000处可清晰 地发现1条抗原、抗体特异性结合带(图4)。

图4融合蛋白的Western blot分析

Fig4Western blot analysis for fusion protein

M:Marker(Mr)(staining with amino black 10B);

1,2:Fusion protein probing with anti-IFNα mAb-HRP;

3:DH5α control(probing with anti-IFNα mAb-HRP).

3讨论

HBV Pre S2蛋白的重要特性之一，是具有PHSAR活性，在PHSA介导下可与肝细胞膜上的同类受体结合，成为HBV嗜肝