摘要：目的了解HSP90β反义核酸转染细胞中HSP90β蛋白的表达。方法通过lipofectamine介导将HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901、人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109。经用G418进行筛选，对筛选出的阳性克隆用Westernblot检测HSP90β蛋白的表达。结果pcDNA-HSP90转染人胃癌细胞系SGC7901，人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR，人肝癌细胞系HCC7402及人食管癌细胞系Ec109后，用G418筛选出的阳性克隆，分别被命名为:AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109。Westernblot检测结果表明，AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109表达的HSP90β蛋白低于其亲本细胞。结论HSP90β反义核酸可封闭HSP90βmRNA，使p

cDNA-HSP90转染的细胞AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC7402及AH-Ec109表达的HSP90β蛋白减少，为研究HSP90下调对肿瘤细胞生 物学活性的影响提供了实验材料。

中图号：Q78文献标识码：A

文章编号：1007－8738(2000)02－0124－04

The expression of HSP90β protein in HSP90β antisense RNA vector- transfected cells

LIU Xian- lingXU LiGUO Jian- chengXIAO BingYU Zhao caiFAN Dai- ming

（Institute of Digestive Disease, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province,China）

Abstracts: Aim To evaluate the expression of HSP 90β protein in HSP 90β antisense RNA vector- transfected cells. Methods pcDNA- HSP90 of HSP90β antisense RNA recombinant was transfected through mediation of lipofectamine into human gastric cancer cell line SGC7901, MDR- type human gastric cancer cell line SGC7901/VCR, human hepatic cancer cell line HCC7402 and human esophageal cancer cell line Ec109. Positive clones were selected with G418. The expression of HSP- 90β protein was assayed by Western blot. Results G418 screened positive clones from pcDNA- HSP90 transfected cells were named AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR,AH- HCC7402 and AH- Ec109 respectively. Western blot showed that the expression of HSP90β protein in AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR, AH- HCC7402 and AH- Ec109 cells was lower than that in their parental cells. Conclusion The expression of HSP90β protein in AH- SGC7901, AH- SGC7901/VCR, AH- HCC7402 and AH-Ec109 cells was decreased owing to the blocking roles of HSP90β antisense RNA to HSP90 mRNA in those cells. This supplied experimental materials for studying the effects of the down- regulation of HSP90β on biological activity of tumor cells.

Keywords: HSP90β ； antisense RNA;gene transfection; Western blot

HSP90为生物进化过程中一种高度保守的胞浆蛋白质，约占胞浆蛋白的1％～2％。HSP90在体内多为二聚体。在较高等的真核生物体内，HSP90有两种，即α型和β型，两者分别由730和724个氨基酸组成，其同源性为84％。它们分别由不同的基因编码。HSP90α与HSP90β为组成型表达，应激（如高温、感染）可诱导其生成增加，诱导因素不同，对α及β的诱导有所不同。相比之下，HSP90α易受热诱导，而HSP90β易受有丝分裂原诱导。

近年发现，HSP90与肿瘤关系较密切^[1－3]。肿瘤细胞中HSP90的表达比正常细胞高2～10倍。HSP90α可通过调节细胞周期促进细胞增殖，HSP90β能够抑制细胞凋亡与分化^[4，5]。最近有人报道，HSP90β还与P-gp的表达有关^[6]。本研究拟用HSP90β反义核酸载体转染人胃癌细胞系SGC7901及其多药耐药细胞系SGC7901/VCR、人肝癌细胞系HCC7402和人食管癌细胞系Ec109，以建立HSP90β蛋白的低表达细胞系,为进一步研究HSP90β对消化系肿瘤细胞生物学活性的影响，以及HSP90β与耐药的关系提供实验材料。

1材料和方法

1．1材料人胃癌细胞系SGC7901从军事医学科学院毒物研究所引入。人胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR由本研究所提供。人肝癌细胞系HCC7402由本校病理学教研室提供。人食管癌细胞系Ec109由本校生物化学教研室提供。HSP90β反义核酸重组子pcDNA-HSP90由作者等^[7]构建。pcDNA3.1(＋)由美国杨静华提供。Lipofactamine，G418，RPMI1640（Gibco公司）。小牛血清（浙江金华公司）；山羊抗人HSP90β多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology，Inc)，生物素化的兔抗山羊IgG，SABC试剂盒(武汉BosterInc)；DAB（华美公司）；三去污剂裂解缓冲液[50mmol/LTris·ClpH8.0，150mmol/LNaCl，0.2g/L叠氮钠，1g/LSDS，100mg/LPMSF（Sigma公司），1mg/Laprotinin（Sigma公司），10g/LNP-40及5g/L去氧胆酸]；丙烯酰胺，N，N-亚甲双丙烯酰胺（上海华美公司）；TBE（89mmol/LTris-硼酸；2mmol/LEDTA）；100g/L过硫酸铵；100g/LSDS；TEMED（Sigma公司）；Tris-甘氨酸工作液（25mmol/L Tris碱，250mmol/L甘氨酸，1g/LSDS）；2×SDS凝胶加样缓冲液（100mmol/LTris·ClpH6.8，200mmol/LDTT，40g/LSDS，2g/L溴酚蓝，200mL/L甘油）；电转移缓冲液（39mmol/L甘氨酸，48mmol/LTris碱，0.37g/LSDS，200mL/L甲醇 ）及四氯萘酚（上海华美公司）。

1.2方法

1.2.1重组质粒的转染及阳性克隆的筛选实验组转染pcDNA-HSP90；空载体对照组转染pcDNA3.1(＋)。SGC7901，SGC7901/VCR，HCC7402和Ec109细胞作为相应的空白对照组。以碱裂解法提取重组质粒pcDNA-HSP90，经PEG纯化。用lipofectamine介导基因的转染（按说明书进行）：即在接种于6孔板中的细胞达到80％融合时，用无双抗、无血清RPMI1640培养液洗涤细胞，加入质脂体包裹的质粒，37°C50mL/LCO2培养6h。然后，更换用含100mL/LFBS的RPMI1640液继续培养48～72h后，加入G418（400mg/L）进行抗性筛选。3～4wk后，见有抗性细胞集落形成时，挑选细胞克隆，用含100mg/LG418的100mL/LFBS-PRMI1640液扩大培养。其中pcDNA-HSP90转染组经G418筛选出的克隆，分别被命名为:AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC74O2及AH-Ec109。pcDNA3.1（＋）转染组筛选出的克隆，分别被命名为：SGC701-pcDNA，SGC7901/VCR-pcDNA，HCC7402-pcDNA及Ec109-pcDNA。

1.2.2培养细胞的裂解及蛋白定量细胞接种于直径90mm的平皿，于37°C，50mL/LCO2饱和湿度下培养至细胞长满平皿。取出平皿，用冷PBS洗2次，加入预冷至0°C的三去污剂裂解缓冲液1mL裂解细胞，用移液枪将细胞碎片移入一只Ep管中，同时加入10μLPMSF，置4°C30min，离心(12000r/min)2min。取上清，分装于Ep管中，于－20°C保存备用。同时，取少许用Photometrey分 析仪进行蛋白定量。1.2.3HSP90β蛋白表达的检测取各种细胞裂解液，调整含量后每样品上样10μL，进行SDS－PAGE及免疫印迹。于NC膜上依次加入山羊抗人HSP90β一抗（1∶100）室温作用2h，及辣根过氧化酶标记的驴抗山羊IgG（1∶500）室温作用1h。PBS洗涤后，用四氯萘酚显色并拍照。用Quantimet570(Germany,LeicaInc.)图象分析仪（QUIC图象系统）对免疫印迹的结果进行半定量分析。条带的染色强度以灰度值表示（256级灰度，黑色的灰度值最小为0 ，白色的灰度值最大为255）。

2结果

2．1阳性克隆的筛选pcDNA-HSP90载体转染SGC7901，SGC7901/VCR，HCC7402及Ec109细胞后，用G418进行筛选。对筛选出的相应阳性克隆，分别命名为：AH-SGC7901，AH-SGC7901/VCR，AH-HCC74O2及AH- Ec109（图1）。

图1pcDNA-HSP90转染的细胞经G418筛选出的阳性克隆

Fig1pcDNA-HSP90 transfected positive clones selected with G418

1：AH-SGC7901；2：AH-SGC7901/VCR；3：AH-HCC74O2；4：AH-Ec109.

2.2HSP90β蛋白的表达将Western blot的结果用Quantimet 570图象分析仪进行分析（图2）。结果表明，SGC7901细胞与SGC7901－pcDNA细胞的平均灰度值为61.4±2.4及61.2±3.3,二者无显著差异(P＞0.05)；AH-SGC7901细胞的平均灰度值为83.2±2.9,明显大于前两者(P＜0.05)，即AH-SGC7901细胞中HSP90β蛋白的表达明显低于其亲本细胞及其空白对照细胞。SGC7901/VCR细胞与SGC7901/VCR-pcDNA细胞的平均灰度值分别为37.5±3.7及38.9±3.3,二者无显著差异(P＞0.05);AH-SGC7901/VCR细胞的平均灰度值为80.5±3.6,明显大于前两者(P＜0.05)，即AH-SGC7901/VCR细胞中HSP90β蛋白的表达，明显低于其亲本细胞及其空白对照细胞。HCC7402细胞与HCC7402－pcDNA细胞的平均灰度值分别为93.5±3.4及89.1±3.5, 二者无显著差异(P＞0.05);AH-HCC7402细胞的平均灰度值为156.8±2.8,明显大于前两者(P＜0.05)，即AH-HCC7402细胞中HSP90β蛋白的表达，明显低于其亲本细胞及其空白对照细胞。Ec109细胞与Ec109－pcDNA细胞的平均灰度值分别为81.8±4.0及81.2±3.3,二者无显著差异(P＞0.05);AH-Ec109细胞的平均灰度值为103.2<