摘要:目的探讨青春型双歧杆菌对巨噬细胞Μ功能的调节作用。方法将双歧杆菌注射于裸鼠腹腔，用小鼠胸腺细胞增殖法、L929细胞体外杀伤法及Griess试剂，分别测定裸鼠腹腔Μ产生的IL1，TNFα及NO的水平；同时观察了Μ体外杀瘤活性的变化。结果双歧杆菌注射组裸鼠腹腔Μ产生的IL1，TNFα及NO的水平分别为：0.55±0.024(A值)，(165±41)103U/L及(53±6)μmol/L；对照组分别为：0.34±0.021(A值)，(12±6)103U/L及(31±13)μmol/L。三组数据各自比较均有显著性差异(P＜0.01)。同时，体外杀瘤活性也明显增强(P＜0.01)。结论青春型双歧杆菌能激活Μ，增强其杀瘤活性，并使之分泌大量的细胞毒性效应分子。

中图号：R378.99文献标识码：A

文章编号:1007－8738（2000）01－0035－37

Effects of bifidobacteria on cytokine production and cytotoxicity by peritoneal macrophages of nude mice

WANG Li-sheng, PAN Lin-jia, SHI Li, SUN Yong, ZHANG YA-li, ZHOU Dian-yuan

Chinese PLA Institute for Digestive Medicine, Nanfang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China

Abstract:Aim To explore the regulative effect of Bifidobacteria adolescence on macrophage functions. Methods The interleukin 1, tumor necrosis factor-α and nitric oxide(NO) levels produced by peritoneal macrophages of nude mice were separately detected by mouse thymocyte proliferation test,L929 cell killing method in vitro and Griess reagent, after Bifidobacteria adolescence were injected peritoneally into the nude mice. Tumoricidal activity of the macrophages in vitro was also observed at the same time. Results The IL-1, TNF-α and NO levels secreted from peritoneal macrophages of nude mice were 0.55± 0.024(A value),(165± 41)× 103U/L and(53± 6)μ mol/L in experimental group respectively; they were 0.34± 0.021(A value),(12± 6)× 103U/L and (31± 13)μ mol/L respectively in control group. They were significantly higher in experimental group than those in control group (P＜ 0.01). Simultaneously the tumoricidal activity of the macrophages in vitro was also markedly promoted(P＜ 0.01). Conclusion Bifidobacteria adolescence could activate macrop-hages to secrete a lot of cytotoxic effectors and enhanced its tumoricidal activity.

Keywords:bifidobacterium adolescence; macrophage;cytokine; nitric oxide

双歧杆菌是人体肠道内数量最多、功能最重要的生理有益菌，在体内发挥着生物学屏障、抗感染、抗突变及抗肿瘤等多种重要的生理功能^〔1〕。此外，它还能激活巨噬细胞、NK细胞和其它免疫效应细胞，使之分泌多种细胞因子及重要介质^〔2〕。为进一步探讨青春型双歧杆菌对裸鼠腹腔功能的影响，我们检测了该菌激活裸鼠腹腔后，产生的IL-1、TNF-α及NO的水平，及其体外杀瘤活性的变化。

1 材料和方法

1.1 材料 双歧杆菌由本所从健康婴儿粪便中分离，经API-20A及TAB系统(英国)和多次生化反应鉴定为青春型双歧杆菌。实验时将双歧杆菌接种至硫乙醇酸盐肉汤中，置厌氧培养箱于37℃培养72 h。取其培养物，以3 000 r/min离心10 min，去上清，沉渣以PBS液洗3次，调整细菌数为1×10¹³/L。实验动物为Balb/c(nu/nu)鼠，6～8周龄，雌雄各半，体重18～23 g，购于本校实验动物中心，饲养于SPF级动物室。实验动物分两组：1双歧杆菌注射组：于实验第1天，向裸鼠(10只)腹腔注射100 g/L硫乙醇酸盐肉汤2 mL，2 d后，腹腔注射双歧杆菌2×10⁹(0.2 mL)，1次/d，连续5 d；2对照组：动物数量及第1天的处理均同双歧杆菌注射组。不同之处为从第2天起，向其腹腔注射PBS液0.2 mL，1次/d，连续5 d。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠腹腔巨噬细胞的培养 于实验的第7天，处死全部动物，常规消毒裸鼠腹部皮肤，以冷的DHanks液灌洗腹腔。收集洗出液，以1000 r/min离心10 min，去上清，沉渣以无血清RPMI 1640培养液重悬2次，调整细胞数为1×10⁹/L。吸取100 μL细胞悬液，加至96孔细胞培养板中，置37℃，50 mL/L CO₂孵育箱中培养2 h。洗去未贴壁的细胞，加入含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液及LSP(终质量浓度为10 μg/L)继续培养、诱导24 h后，收集孔内上清液，置－30℃保存。

1.2.2 IL-1的活性测定 采用小鼠胸腺细胞增殖法。无菌取出C3H/HeJ小鼠胸腺，研磨过筛，制成密度1×10¹⁰/L的单细胞悬液，内含1 mg/L的ConA(Sigma产品)。吸取细胞悬液加至96孔细胞培养板中(100 μL/孔)。然后分别加入等测上清(100 μL/孔)。同时设阴性对照、培养液对照及ConA对照。每份样品设3个复孔，置37℃，50 mL/L CO₂孵箱中孵育72 h。最后4 h，每孔加入20 μL/ MTT(5 g/L)，继续培养4 h，吸弃每孔上清180 μL，再加入100 μL二甲亚砜，振荡5 min，于BioRad550型酶标仪上读取波长为490 nm处的吸光值(A值)。

1.2.3 TNF-α的活性测定 采用L929细胞体外杀伤法。具体操作步骤为：①收集对数生长期的靶细胞L929，用含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞密度为2×10⁸/L；②将待测上清以2倍连续稀释后，加于96孔细胞培养板中(100 μL/孔)。每一样品设3个复孔；③每孔加入L929细胞悬液100 μL，同时设空白对照组及单独细胞对照组；④于37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养24 h，用生理盐水洗涤细胞3次；⑤每孔加入5 g/L中性红染色液200 μL，于37℃培养1 h，使活细胞充分着色；⑥以生理盐水冲洗2次，扣干，每孔加入脱色液(0.1 mmol/L Na2HPO4和900 mL/L乙醇等量混合液)200 μL，静置5 min；于酶标仪上读取波长为530 nm处的A值。结果判定：以能导致细胞50％死亡的最大稀释倍数判定为1×10⁸U/L。细胞死亡率的计算公式如下：

1.2.4 NO水平的测定 将1 mmol/L的NaNO2对倍稀释后，加入等体积的Griess试剂(以蒸馏水配制1 g/L盐酸萘乙二胺；50 g/L磷酸配制10 g/L磺胺嘧啶，临用前两者等量混合)，室温下轻轻摇振10 min，于Bio-Rad 550型酶标仪上读取波长550 nm处的A值。每一样品设3个复孔，取其平均值，制备NO标准曲线。取待测上清100 μL，加入300 g/L硫酸锌5 μL去除蛋白质，以5000 r/min离心10 min，收集其上清，与等体积的Griess试剂混合。室温下轻轻摇振10 min，于酶标仪上读取波长550 nm的A值。

1.2.5 杀伤活性的检测 以L1210细胞为靶细胞，用MTT间接比色法检测^〔3〕。收集对数生长期的L1210细胞，经Hanks液洗后，用RPMI 1640完全培养基配成1×10⁸/L备用。在96孔板中，加入1×10⁹/L(100 μL/孔），2 h后洗去非贴壁的细胞，再加入L1210细胞(100 μL/孔)，效靶比例为10∶1。每一样品设3个复孔，同时设L1210细胞对照。于37℃作用24 h后，振荡培养板使L1210细胞充分悬浮，每孔吸取100 μL的L1210细胞加入另一96孔板中。加入20 μL/孔的MTT(5 g/L)，继续培养4 h后，再加入100 g/L SDS 100 μL，6～8 h后，于酶标仪上测定570 nm的A值。并按下式计算杀伤活性。所得结果采用t检验表示。

2 结 果

2.1 双歧杆菌对产生IL-1及TNF-α的影响 用小鼠胸腺细胞增殖法及L929细胞体外杀伤法，分别检测了IL-1及TNF-α的活性。结果表明，双歧杆菌注射组裸鼠腹腔产生的IL-1及TNF-α的活性，显著高于对照组(P＜0.01，表1)。

2.2 双歧杆菌对Μ产生NO及细胞毒活性的影响 将一系列不同浓度的NaNO2标准品与测定的对应A值作一标准曲线，并进行直线相关回归分析，得出其直线回归方程为Y=0.01＋0.02X,r=0.999。将不同标本测得的A值代入该直线回归方程中，即可得到相应的NO含量。经统计学处理发现，双歧杆菌注射组裸鼠腹腔产生NO的量显著高于对照组(P＜0.01，表1)。此外，以L1210细胞为靶细胞，以MTT间接比色法观察了Μ杀伤活性的变化。结果表明，双歧杆菌注射组裸鼠腹腔Μ的杀