摘要:目的建立一种人外周血γδ＋T细胞体外选择性扩增的模式：即在IL2的作用下，不需要γδ＋TCR特异性配体(或抗原)的刺激，可使一类个体体外培养的外周血单个核细胞(PBMC)中的γδ＋T细胞发生优先增殖，逐渐成为培养细胞的主要群体。方法将10个γδ＋TCR的个体的PBMC分别在含3×105U/LIL2培养液中培养1～2wk后，其中的γδ＋T细胞的比率可达38％～78％。结果对3个这样的个体的扩增细胞做RTPCR分析表明，扩增出的γδ＋T细胞表达TCRVδ₂基因片段。这种γδ＋T细胞体外优先扩增的性质类似于记忆性αβT细胞的体外生长特征，可能反映了γδ＋T细胞在体内的致敏状态。结论该现象将有利于进一步了解γδ＋T细胞在免疫系统中的地位和进化上的意义。

中图号：R371.22文献标识码：A

文章编号:1007－8738（2000）01－0031－34

Preferential expansion of primed human γδ＋T cells in culture

CHEN Song-huaLIU WeiDAI Hui-ming CHE Yu-fang WANG Jue GE Xi－rui

（Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China）

Tadao OHNO

（Riken Cell Bank, Institute of Physical and Chemical Research(Riken) Tsukuba Science City, Japan ）

Abstract:Aim To establish one pattern of human peripheral γδ＋ T cells growth in vitro. Methods Without the stimulation of specific γδ＋ TCR ligands, the γδ＋T cells in the cultured peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of 10 selected donors preferentially proliferated in a dose-dependent manner to IL-2. After 6-14 days of culture in the medium containing 3× 10⁵U/L IL-2, the percentages of γδ＋T cells rose to 38％ -78％ with the increase of cumulative cell numbers. Results RT-PCR analysis of the expanded γδ ＋ T cells from 3 typical donors showed that they expressed TCR Vδ₂ gene fragments. This kind of γδ ＋ T cell expansion was similar to the memory αβT cell growth in vitro, which might represent the primed state of γδ ＋ T cells in vitro. Conclusion This phenomenon will be beneficial for the understanding of γδ ＋ T cells positions in immune system and significance in evolution.

Keywords: γ δ ＋ T cell;expansion in vitro; primed state; TCR Vδ₂ gene fragment

虽然大量的实验结果已经表明，γδ^＋ T细胞在机体抗感染、抗病毒和抗肿瘤的免疫应答过程中，以及在某些自身免疫疾病的发生过程中具有重要的作用^〔1〕，但人们对γδ^＋T细胞独特的生理功能和其在免疫进化上的意义，仍然没有获得明确的认识^〔2〕。早期的研究报道，正常人外周血和淋巴器官中，γδ^＋ T细胞虽只占CD3＋T细胞数量的约5％^〔3〕，但研究γδ^＋T细胞增殖活化的条件，对了解γδ^＋T细胞的功能和地位具有关键的作用^〔4〕。在前期工作中，我们采用γδ^＋TCR特异性配体磷酸单乙酯(monoethylphosphate,MEP)^〔5〕和IL-2共刺激的方法，成功地建立了一种从人PBMC中，选择性扩增γδ^＋T细胞的培养系统：即不同个体的PBMC中的γδ^＋T细胞，对MEP和IL-2的共刺激表现出不同程度的增殖反应，表明这种γδ^＋ T细胞的选择性扩增依赖于MEP和IL-2的共同作用^〔6〕。在本实验中我们观察到，有一类个体的外周血γδ^＋T细胞具有一种不同的体外选择性扩增模式：即在含有IL2的培养条件下，不需要MEP的作用。这类个体PBMC中的γδ^＋T细胞就可明显地优先增殖，并逐渐成为培养细胞中的主要群体。我们将这类个体称之为γδ^＋T细胞致敏(primed)型个体，将这种反应称为致敏型γδ^＋T细胞扩增。我们进一步对所扩增出的几个个体的γδ^＋T细胞的亚型做了一些研究，并对这种现象的免疫生物学意义做了一些初步的分析和讨论。

1 材料和方法

1.1 材料 重组IL-2购自上海华新生物高科技公司。聚蔗糖－泛影葡胺(FicollHypaque)淋巴细胞分离液(比重1.077)为上海试剂二厂产品。RPMI 1640培养基为Gibco公司产品。PE标记的小鼠抗人TCR γ/δ-1单克隆抗体(mAb)为Becton Dectio Dickinson公司产品。RNA抽提试剂由本实验室根据Chomczynski等^〔7〕的方法配制。mRNA逆转录引物(Random Hexamer Primer)，购自Pharmacia公司。M-Mu-LV转录酶及其反应缓冲液，为Gibco公司产品。Taq酶及其反应缓冲液，购自Promega公司。0.1 mol/L DTT，2.5 mmol/L dNTPs及PCR DNA marker，均为华美生物工程公司的产品。用于PCR扩增的6个分别针对不同亚类的TCR Vδ区引物(forward)和一个共同的TCR Cδ区引物(reverse)，均由细胞所DNA合成组根据Falk等〔8〕报道的序列合成。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的分离培养和FACScan分析 用肝素抗凝，无菌取人PBMC，置于24孔培养板（Gibco）中，在37℃，50 mL/L CO₂的饱和湿度条件下培养（细胞密度为5×10⁸／L）。培养液为含100 mL/L自体血浆（autoplasma）及分别含不同浓度IL-2的RPMI 1640培养基。培养3 d时，换1／2培养液。在随后的培养时期，每2～3 d常规传代培养。传代培养液与原代培养液相同，传代细胞的浓度为5×108/L。在一定的培养时期，用血球细胞计数器测定培养细胞的浓度，计算出累积细胞总数。根据标准染色方法(Becton Dickison Monoclonal Antibody Source Book)，用PEanti TCRγ/δ-1 mAb将培养细胞染色，用流式细胞仪(FACScan)分析γδ＋T细胞的比率。

1.2.2 RT-PCR分析γδ-TCRVδ RNA抽提采用异硫氰酸胍－苯酚－氯仿一步法，从约3×10⁶个培养细胞中抽提获得总RNA^〔7〕。经真空干燥后，用25 μL DEPC水溶解总RNA。cDNA合成：取7 μL总RNA(约10 μg)和1 μL(25 pmol)Random Primer加入0.5 mL EP管中，混匀，65℃水浴5 min后，放入冰中冷却。然后，再加入2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，5×反转录缓冲液4 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL，M-MuLv反转录酶(200U)1 μL及ddH2O 1 μL，混匀。于37℃水浴1 h后，置－20℃备用。分别用6对引物做PCR扩增γδ^＋TCR的Vδ-Vδ6基因片段^〔8〕：即在0.5 mL EP管中，加入cDNA 1 μL，1个Vδ区引物和共用的Cγ区引物各1 μL(25 pmol)，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L MgCL2 3 μL及Taq酶5 μL，用ddH2O补充至 50 μL。然后，在DNA扩增仪上进行PCR扩增。反应温度为94℃ 1～2 min，50℃ 45 s和72℃ 1 min。35个循环之后，保温于72℃ 5 min。经20 g/L琼脂糖潜水电泳、EB染色后，拍照。

2 结 果

2.1 致敏型γδ^＋T细胞的体外增殖 通过对50个个体的PBMC所做的实验，我们筛选了10个γδ^＋ T细胞致敏型个体(Lu YG,Chen SH, Tao G, Huang YM, Wang W, Shi WP, Wang ZY，Chen.Y，Hung TY, Hao GC)。当这类个体的PBMC分别在含3×105 U/L IL-2和100 mL/L自体血浆的RPMI 1640培养液中培养1～2 wk后，培养细胞的总数可增加1～10倍，γδ^＋T细胞的比率可达到38％～78％。γδ^＋T细胞的比率是在培养过程中逐渐增加的。图1显示的为典型致敏个体Lu YG的外周血γδ^＋T细胞对不同剂量IL-2的体外增殖反应过程。从图1可看出，培养8 d，γδ^＋T细胞增殖的总数与IL-2的浓度呈剂量依赖关系。

图1 致敏个体Lu YG的外周血γδ^＋T细胞对不同剂量

IL-2的体外生长曲线

Fig 1 Growth curves of γδ^＋ T cells from primed donor Lu YG

in RPMI 1640 medium containing different contents of

IL-2 and 100 mL/L autoplasma

2.2 致敏型γδ^＋T细胞的TCRVδ亚型分析 我们采用RT-PCR方法，分析了几个致敏个体Chen SH，Lu YG和Wang ZY的体外扩增的致敏型γδ^＋T细胞的TCR Vδ基因片段。结果表明，致敏型γδ^＋T细胞表达Vδ2片段。图2A显示，体外培养细胞中的γδ^＋T细胞的比率已达84％。图2B显示，由Vδ2-Cδ这一对引物所扩增出的DNA带约为400 bp(大小与设计相符合)。阴性对照(加相对应的RNA，不加模板cDNA)表明，PCR实验无外源性污染，扩增的Vδ2基因片段是特异性的。用另外5对分别针对其它亚类的TCR Vδ区域的引物所做的实验，均没有扩增出特异性条带。

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