摘要:目的表达抗人肺癌单克隆抗体(mAb)LC-1的人-鼠嵌合基因工程抗体。方法将mAbLC-1的VL和VH基因插入质粒pWS1中，构建成表达mAbLC-1人-鼠嵌合Fab片段基因的质粒pLC-1，转化大肠杆菌TG-1并在其中表达。结果酶切鉴定表明，mAbLC-1的VL和VH基因插入方向正确，该载体能在大肠杆菌TG1中表达预期相对分子质量的蛋白，表达产物对mAb具有较强的竞争结合抗原的活性。结论成功地表达了具有较高亲和活性的人-鼠嵌合抗人肺癌的基因工程抗体。

中图号：Q78文献标识码：A

文章编号:1007－8738（2000）01－0063－66

Construction and expression of recombinant plasmid pLC-1 bearing human-mouse chimeric Fab fragment gene of mAb LC-1 to human pulmonary carcinoma

CHEN Liang, XIE He-huang, WANG Jue, FAN Zhao-juan, LIN Xin-kai, CHEN Song-hua, LIU Wei, GE Xi-rui

Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031, China

Abstract: Aim To express human-mouse chimeric genetic engineering antibody of monoclonal antibody(mAb)LC-1 to human pulmonary carcinoma. Methods VL and VH genes of the mAb LC-1 were cloned into plasmid pSW1 and then plasmid pLC-1 expressing human-mouse chimeric Fab fragment gene of the mAb LC-1 was constructed. The plasmid pLC-1 was transformed into E.coli TG-1 and expressed in it. Results Restriction enzyme digestion showed that the VL and VH genes of the mAb LC-1 were inserted into plasmid pSW1 in correct direction. Expression products of plasmid pSW1 in E.coli TG-1 could compete against mAb LC-1 in binding to antigen. Conclusion Human-mouse chimeric genetic engineering antibody to human pulmonary carcinoma is successfully expressed, with higher affinity activity.

Keywords: pulmonary carcinoma; monoclonal antibody; plasmid; prokaryotic expression

传统的Fab片段是将小鼠腹水中的mAb，经透析、提纯、酶切而得到，操作较繁。而原核表达系统则具有独特的优点，即操作简便、表达量大和费用低廉等。1988年，Skerra等^〔1〕用大肠杆菌表达了Fv基因片段。实验证明，V_L和V_H都能正确地折叠，并可聚合成有功能的F_v。对V_L和V_H的蛋白测序证实，细菌对信号肽能正确地切除。Better等^〔2〕也报道了有结合活性的Fab片段。此后，国际上许多实验室都用细菌来表达Fab片段。本实验室研制的mAb LC-1是分泌小鼠IgM的mAb，能对4种不同病理类型的肺癌起反应^〔3〕。我们还构建了表达抗人肺癌mAb LC-1人鼠嵌合Fab片段基因的质粒pLC-1，并对表达的嵌合Fab片段做了初步的分析鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料 大肠杆菌TG1由本实验室保存。pSW1质粒由英国Winter实验室构建，本所叶敏教授惠赠；质粒pSW1是表达人－鼠嵌合Fab片段基因的质粒，V_L和V_H为鼠源性的。C_H为人源性HuC_H1，C_L为人源性HuCκ。嵌合性重链和嵌合性轻链分别由分泌到细菌周质的pelB信号肽引导，并都处在同一乳糖操纵子的控制下。人肺腺癌细胞株SPC-A-1细胞和分泌mAb LC-1的杂交瘤细胞株，均由本实验室提供。从LC-1杂交瘤细胞提取总RNA，经RT-PCR扩增并测序的V_H基因和V_L基因，分别以pBluescript-V_H和pBluescript-V_L的形式插入pBluescript质粒中^〔4〕，由本实验室保存。限制酶Pst I，BstE II，Sac I和Xho I，以及T4DNA连接酶和低熔点胶，均为Promega公司的产品。酶标记的羊抗鼠IgM为Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 mAb LC-1人鼠嵌合Fab片段基因表达质粒的构建 用Sac I和Xho I双酶切质粒pBluescript-V_L质粒，低熔点胶回收小片段；再用同样的双酶切质粒pSW1，回收大片段。将两者连接起来，构建成质粒pSW-V_L，并按文献^〔5〕的方法，转化大肠杆菌。用Pst I和BstE II对pSW-V_L双酶切，并用低熔点胶回收大片段；再用同样的酶双酶切从质粒pBluescript-V_H中，扩增的VH基因的PCR产物。将两者连接起来，构建成质粒pLC-1，转化大肠杆菌TG1。

1.2.2 细菌周质蛋白的抽提 挑取单个细菌克隆，接种于入LB培养液中，于37℃以250r/min振摇培养至A600nm为0.8。将此菌液以1/10的量接种入2×TY培养液（含终浓度为1 mmol/L的IPTG）中，37℃ 250 r/min振摇2.5 h。细菌周质蛋白的抽提按文献^〔1〕的方法进行，抽提液装入透析袋，4℃过夜。

1.2.3 蛋白电泳 蛋白的还原性和非还原性SDS－PAGE，按文献^〔6〕的方法进行。

1.2.4 竞争ELISA 以5万个SPC-A-1细胞/孔包被96孔板，按常规进行竞争ELISA。

2 结 果

2.1 质粒pLC-1的构建 质粒pLC-1的构建见图1。我们分别用Pst I和BstE II双酶切及Sac I，Xho I双酶切，能切出相应的相对分子质量的条带，证明LC-1的VL基因和VH基因已被正确地插入到质粒pSW1中（图2）。

图1 mAb LC-1的人-鼠嵌合性Fab片段的基因示意图

Fig 1 Schematic diagram of humanmouse chimeric Fab gene of mAb LC-1

图2 pLC1的限制内切产物的电泳

Fig 2 Electrophoresis of pLC-1 digested with restriction

enzymes

1：Digested with BstE II and Pst I; 2: Digested with Pst I; 3:Digested with Xho I and Sac I; 4:Digested with Xho I; 5:Standard DNA molecular marker(pBR322 DNA/Msp I).

2.2 蛋白电泳 从转染pLC-1的细菌表达物的还原性SDS-PAGE中可看到，在相对分子质量(Mr)为28处和23处有蛋白条带。从扫描图上也可以看到同样的峰值，和预期的嵌合性重链和嵌合性轻链的Mr相一致。而对照TG1细菌在该Mr处则没有蛋白条带。从转染pLC-1的细菌表达物的非还原性SDS-PAGE凝胶上可看出，转染pLC-1的细菌的Mr为51处有蛋白条带(图3)。从扫描图谱上也可看到同样的峰值，和预期的嵌合Fab片段的Mr相一致，而对照TG1细菌在该处没有蛋白条带(图4)。

2.3 竞争ELISA 所获结果表明，转染pLC-1的细菌的表达的Fab嵌合抗体对mAb LC-1有较强的竞争结合抗原的活性(图5)，各组浓度依赖的A600nm值曲线见图6。

图3 细菌周质蛋白电泳的扫描

Fig 3 Scan of SDS-PAGE of periplasmic protiens of bacteria

a: Reductive SDS-PAGE of periplasmic proteins of bactertia pLC-1; b: Reductive SDS-PAGE of periplasmic protiens of bacteria TG1; c: Standard protien marker(Mr); d: Nonreductive SDSPAGE of periplasmic protiens of bacteria pLC-1; e: Nonreductive SDSPAGE of periplas

mic protiens of bacteria TG1.

图4 细菌表达产物的SDS-PAGE

Fig 4 SDS-PAGE of periplasmic proteins of bacteria

1: Reductive SDS-PAGE of periplasmic proteins of bacteria pLC-1;

2: Reductive SDS-PAGE of periplasmic proteins of bacteria TG1;

3: Standard protein marker(Mr×10³)(97.4,66.2,43.0,31.0,20.1,14.4);

4: Nonreductive SDS-PAGE of periplasmic proteins of bacteria pLC-1;

5: Nonreductive SDS-PAGE of periplasmic proteins of bacteria TG1；

1Protein band of chimeric Fab；2Protein band of chimeric heavy chain；3Protein band of chimeric light chain.

图5 嵌合性Fab片段对mAb LC-1的竞争抑制作用

Fig 5 Inhibitory effect of chimeric Fab on mAb LC-1