摘要:目的gp130(亦称CD130)可与许多细胞因子受体(IL6R,IL11R,OSMR,LIFR,CNTFR和CT1R)组成受体复合物,并在这类细胞因子的信号转导中起着重要的作用。方法以痘苗病毒为载体构建获得的可溶性CD130(sCD130)为免疫原，通过细胞融合的方法，得到4株稳定分泌抗CD130单克隆抗体(mAb)（L2,L4a,L4b和L5）的杂交瘤细胞株。结果本组mAb对靶细胞具有识别特异性，不但可识别相对分子质量（Mr）为98000的sCD130分子,也可识别Mr为130000的膜表达型CD130分子（mCD130）。另外，mAb还可与CD130分子形成免疫复合物，用于免疫沉淀CD130分子，但这组抗体中仅mAbL2可部分组断IL6对靶细胞的增殖作用。结论成功地研制了抗人gp130分子mAb。

中图号:R392文献标识码:A

文章编号:1007－8738（2000）01－0074－77

Preparation and characterization of monoclonal antibodies to human gp130

LI Yan,LI Xiao-jun,HE Yong-huai, LAI Cung-ning, NI Chuang-yuan, HU Mei-ru, DONG Ja-xin, SHEN Bei-fen

Institute of Basic Medical Sciences,Military Academy of Medical Sciences,Beijing 100850,China

Abstract:Aim To prepare and characterize mAb to human gp130,and the receptor complexes, with an important role in cytokine signal transduction , which consist of gp130 also known as CD130 and cytokine receptors (I1-6R,IL-11R,OSMR,LIFR,CNTFR and CT-1R),Methods Soluble CD130 molecule (SCD130) constructed with vacinia virus as vetor was used as antigen to immunize Balb/c mice. Four hybyidome cell lines(L2,L4a,L4b and L5)that could steadily secret anti-gp130 mAb were established. Results The antibody characterization showed that they not only specificaley recognize CD130 molecule with relative molecular mass(Mr)98 000, but also CD130 molecule with Mr 130 000 on the membrane of target cells. Otherwise they could also precipitate CD130 molecule from target cells.The L2 mAb of them could partly block the proliferative effect of IL-6 on target cells. Conclusion Monoclonal antibodies to human gp130 are prepared and characterized.

Keywords: CD130 molecule; anti-CD130 monoclonal antibody

gp130亦称CD130，是一类由胞外区（597个氨基酸残基）、跨膜区（22个氨基酸残基）及胞内区（277个氨基酸残基）组成的单链I型转膜糖蛋白分子，Mr为 130 000～140 000，广泛表达于许多哺乳类动物细胞上。CD130分子可分别与白细胞介素6受体（IL-6R）、白细胞介素11受体（IL-11R）、抑瘤素受体（OSMR）、白血病抑制因子受体（LIFR）、睫状神经生长因子受体（CNTFR）和心肌肥大素受体（CL-1R）组成高亲和力的受体复合物。CD130作为信号转导子，在细胞因子的信号转导中起着重要的作用。CD130的活性改变与某些疾病有关，如：人类多发性骨髓瘤的发生与IL-6和OSM依赖的CD130分子持续激活相关；去除CD130基因的小鼠在胚胎发育中，可出现心室心肌变薄，造血细胞减少，最终导致胚胎死亡；而且该分子的持续激活也可导致心室心肌肥大、高γ蛋白血症和间质性肾小球肾炎^[1,2]。因此，研制抗人CD130分子的mAb，对于探讨CD130分子在与细胞因子相关疾病中的作用机制极为重要。我们应用痘苗病毒系统表达的sCD130为免疫原，免疫Balb/c小鼠，用杂交瘤技术通过细胞融合和筛选，制备了一组小鼠抗人CD130分子的mAb，并进行了特异性和功能的鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠骨髓瘤细胞系（Sp2/0）、CD130分子阳性表达的人骨髓瘤细胞系（SKO-007）、人髓系白血病细胞系（TF-1）和CD130分子阴性表达的人B淋巴细胞系（Raji），均在100mL/L FCS 1640培养体系中培养，使用时活细胞不低于95％。按文献^[4]从健康人外周血中获取人单个核细胞和血小板的方法；扁桃细胞取自手术摘除的扁桃体。FITC标记和辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig由本室制备。蛋白酶抑制剂（1eupaptin,和pepstain A）和蛋白A偶联琼脂糖（protein Aagarose）均为Sigma公司产品。ECL显色体系和X光胶片，均购自Amershen公司。抗人CD130 mAb的标准品为R＆D公司产品。

1.2 方法 痘苗病毒构建的sCD130抗原分子由本室研制^[5]。将抗原与完全福氏佐剂混合免疫Balb/c小鼠，1 mo后，反复加强2次。经间接免疫荧光法测定免疫小鼠血清效价大于1∶800时，常规进行细胞融合。用间接免疫荧光法筛选阳性克隆，再通过亚克隆筛选出能稳定分泌抗人CD130 mAb的杂交瘤细胞系，并制备mAb腹水，以亲和层析法纯化后待鉴定。①间接免疫荧光法：用含20 mL/L FCS，0.2 g/L叠氮钠的10 mmol/L PBS洗涤细胞后，去除全部上清。加入mAb，冰浴中振荡30 min,将细胞洗3遍。加FITC标记的羊抗小鼠I g，冰浴中振荡30 min，再洗涤两遍后，于荧光显微镜下，检查阳性细胞或经流式细胞仪测定阳性细胞率（％）。②mAb的中和试验：取培养在含有GM-CSF的100 mL/L FCSRP- MI 1640培养体系中的TF-1细胞，洗3遍，重新悬浮于100 mL/L FCS-RPMI 1640体系.调整细胞密度为2×10⁴/L，植入含IL-6(10 μg/L)或不含IL－6及不同质量浓度mAb的96孔培养板中，37℃，50 mL/L CO₂ 条件下培养48 h 。加MTT（50 μg/孔），继续培养4～5 h 。加终止液100 g/L SDS－0.1 mol/L HCl)，37℃过夜后，于570 nm测定A值。③免疫沉淀和Western blot:用10 mmol/L PBS (pH7.2)将细胞洗3遍，去除全部上清。加细胞裂解液（20 mmol/L Tris－HC1 pH8.0,137 mmol/L氯化钠，2 mmol/L Na3OV4，10 g/L NP－40，100 mL/L甘油，1 g/L SDS；再新鲜加入1 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptinin和1 mg/L pepstatinA）,冰浴10～20 min, 离心（10 000 r/min）10 min。收集上清与葡萄球菌A蛋白混合，室温反应30～60 min，离心（10 000 r/min）10 min。收集上清与mAb在室温条件下反应30 min,再加兔抗小鼠Ig和蛋白A偶联的琼脂糖，4℃反应过夜。用缓冲液（10 mmol/L TrisHCl和5 mmol/L EDTA）洗4遍后，用蛋白样品处理液处理样品进行SDS PAGE。SDSPAGE后，将蛋白样品经电转印仪（BioRad）转移至硝酸纤维膜上（恒压40 V，4℃ 4 ～5 h）。用50 g/L低脂奶粉封闭膜后，加mAb至膜上置室温中反应1～2 h。充分洗膜后，再加辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠Ig,于室温下反应40～60 min。洗膜4～5遍，用ECL体系反应、X光片分析^[6]。

2 结 果

2.1 杂交瘤细胞系的建立与mAb的反应性 通过细胞融合及亚克隆筛选，选择与SK0-007细胞或TF-1细胞呈阳性反应，而与Raji细胞呈阴性反应的克隆，进行亚克隆，最后获得4株稳定分泌mAb的杂交瘤细胞，分别命名为L2，L4a，L4b和L5。用间接免疫荧光法或细胞流式仪，分析了4株mAb对细胞反应的特异性。实验结果初步证实，4株mAb对SK0-007细胞、TF-1细胞、PBLC细胞、血小板和扁桃细胞，表现出程度不同的阳性反应，而对Raji细胞呈阴性反应。为进一步证实mAb识别CD130分子的特异性，用sCD130重组痘苗病毒和野生型痘苗病毒（sVTT），同时感染CD130阴性反应的Raji细胞。将Raji细胞于37℃培养24 h后，离心取细胞，用免疫荧光和免疫组化法，分别观察4株mAb对Raji-sCD130和Raji-sVTT感染细胞的识别性。免疫荧光结果表明，4株mAb仅对Raji-sCD130感染细胞呈阳性反应，其中mAb L4b的反应性明显强于其它3株mAb；而4株mAb对Raji-sVTT感染细胞均呈阴性反应。应用免疫酶标桥联技术（APAAP）检测的结果与免疫荧光的结果相同，进一步证实4株mAb仅对Raji-sCD130感染的Raji细胞呈阳性反应；而对Raji-sVTT感染的Raji细胞无识别性（图1）。

图 1 sCD130 转染或 sVTT 转染 Raji 细胞的 APAAP 鉴定

Fig 1 Detection of APAAP on Raji cells transfected with sCD130 or sVTT 8 100

A1,A2,A3,A4;mAbs L2,L4a,L4b and L5 reacted positively to Raji-sCD130 cells;

B1,B2,B3,B4,:mAbs L2,L4a,L4b and L5 reacted positively to Raji-sVTT cells.

2.2 mAb对sCD130和mCD130的识别 用浓缩10倍的含sCD130的痘苗病毒上清和空载痘苗病毒（sVTT）上清，进行80g/L SDSPAGE及免疫转印。结果表明，4株mAb均可识别Mr 98 000的蛋白分子。试验所用TK143细胞表达的sCD130浓缩上清，在以往的研究中，已经过标准的抗人CD130 mAb鉴定其蛋白的Mr为98 000[3]；而在空载痘苗病毒上清样品中，未出现4株mAb所识别的Mr为98 000的蛋白条带（图2）。

图2 sCD130和s VTT的Western blot

Fig 2 Western blot of sCD130 and sVTT

为进一步证实4株mAb除识别Mr 98 000的重组sCD130分子外，也可识别天然mCD130分子。试验中应用了TF-1细胞和Raji细胞的裂解液，进行SDSPAGE和Western blot分析