摘要：目的获得CTLA4全长基因并在真核表达系统中表达。方法通过RTPCR方法，从MT2细胞系克隆CTLA4全长基因；经引物重叠和半巢式PCR改造，获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外段DNA，然后克隆至真核表达载体pIg，转染COS和CHOK细胞表达。结果获得了CTLA4全长基因，序列分析表明，该序列与GenBank数据库中的序列一致。在COS和CHO-K细胞培养上清中有CTLA4-Ig的表达，该产物能抑制淋巴细胞转化。结论真核表达体系表达了有生物学活性的CTLA4-Ig。

中图号：Q78文献标识码:A

文章编号:1007－8738（2000）01－0014－17

Expression and biological activities of CTLA4-Ig fusion protein

ZHENG Yu, SHEN Beifeng, LI Yan， SHU Cuiling, HU Meiru, PEI Wuhong, WANG Jianan

Institute of Basic Medical Sciences, Acadamy of Military Medical Sciences, Beijing 100850， China

Abstract: Aim To obtain and express the CTLA4 gene in eukaryocytes. Methods The full gene of the CTLA4 was amplified from MT2 cell lines by RT-PCR, reformed with an overlapping primers and nested primers, then cloned into the expression vector pIg, consequently, the CTLA4-Ig was expressed in the COS and CHO-K after transfection with pIg-CTLA4. Results Sequencing data indicated that the CTLA4 gene was exactly identical to the sequence in the GenBank. The CTLA4-Ig was expressed in the COS and CHO-K and it blocked the lymphocyte transformation. Conclusion The CTLA4Ig with biological activity was expressed in the eukaryotic system.

Keywords: CTLA4；CTLA4-Ig； clone; expression

即溶细胞性T细胞相关抗原4(CTLA4)，是表达在活化T细胞表面的标志分子之一。研究表明，CTLA4是维持体内T细胞稳定的负调控因子，能抑制活化T细胞的增殖，与CD28是一对重要的免疫调控因子^〔1〕。目前，CTLA4被作作为一种免疫抑制受体，对临床移植排斥反应有明显的抑制作用^〔2，3〕。因此，我们克隆了CTLA4的全长cDNA，并表达了CTLA4与人IgGγ链的融合蛋白。

1材料和方法

1.1主要材料MT2细胞株为本室保存。小量DNA纯化试剂盒购自Clontech公司。表达载体pIg由孙凯博士赠送。内切酶购自Biolab公司。RNA提取试剂盒与连接酶购自Gibco公司。载体pGEM购自Promega公司。所用引物P1～P5，均为本室全自动DNA合成仪合成。

1.2细胞总RNA的提取复苏MT2细胞，培养至对数生长期。参照试剂盒说明书提取RNA。最后，将RNA沉淀溶于20μL无RNA酶的水中，测定A280及A260并定量。

1.3RT-PCR取含1μgRNA的溶液，分别加入5×buffer4μL、Oligo(dT)2μL及10mmol/LdNTP8μL，95℃变性2min后卒冷2min。加RNasin1μL，反转录酶5U～10U，42℃保温1h，产物即为cDNA第1链。然后在50μL反应体系中，分别加入cDNA第1链4μL，10×PCRbuffer5μL，P1和P2引物各2μL，2.5mmol/LdNTP4μL，H2O34μL，95℃变性10min，加Taq酶1U～2U。循环参数为：94℃45s，55℃45s，72℃45s，共35次循环，最后于72℃延伸10min^〔4〕。

1.4RT-PCR产物的回收、克隆及序列测定用Clontech公司的小量DNA纯化试剂盒，从琼脂糖凝胶中回收预期产物，并参照载体pGEM使用说明书连入载体pGEM中。酶切鉴定正确后，用全自动DNA测序仪测序。

1.5CTLA4基因的改构用引物P3、P4和P5，通过引物重叠和半套式PCR两次，获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外片段^〔3〕。

1.6CTLA4-Ig表达载体的构建将改造后的目的基因，经限制性内切酶EcoRV和BamHI消化后，连接至经相同内切酶处理的真核表达载体pIg中，酶切鉴定。PCR产物及载体的酶切、克隆及阳性重组子的鉴定，具体操作方法参见《分子克隆》一书〔5〕。

1.7细胞培养与转染调整CHO-K细胞至对数生长期。预先配制下述溶液：在100μL无血清、无抗生素的DMEM中，加入表达质粒DNA5μg，混匀备用；在100μL无血清、无抗生素的DMEM中，加入20μL脂质体，混匀。将上述两种溶液混匀，滴加在欲转染的细胞表面，于37℃、5％CO2条件下培养5h～12h，换有血清的培养液。24h后，换无血清的DMEM培养48h～72h，收集上清^〔6〕。

1.8免疫印迹检测目的蛋白的表达将培养上清直接进行SDS-PAGE后，用抗人IgGFd片段和抗人CTLA4的mAb，做蛋白印迹检测CTLA4-Ig。

1.9CTLA4-Ig生物学活性的检测采用MTT法，测定CTLA4-Ig对正常人外周血中淋巴细胞转化的影响。

2结果

2.1CTLA4基因的克隆与测序根据GenBank数据库中CTLA4的序列，设计并合成了引物P1和P2，引物的序列如下：

P1：5′GCAATGCACGTGGCCCAGCCTGCTGTGGTACTG3′

P2：5′TGATGTAACATGTCTAGATCAATTGATGGGAATAAA-ATAAGGCTG3′

从MT₂细胞中提取总RNA，经甲醛变性电泳检测，表明RNA未降解。用Oligo(dT)反转录得到CTLA4cDNA；用引物P1和P2，经PCR扩增后，获得CTLA4的全长基因。琼脂糖凝胶电泳可见1条约560bp的单一扩增条带，与预期的大小一致。同时，用胞外段下游引物P5与上游引物P3扩增出460bp的片段，与预期的大小一致(图1)。酶切鉴定表明，所得产物为CTLA4基因。回收该产物，插入载体pGEM，鉴定正确的重组质粒，命名为pGEM-CTLA4。对该质粒测序表明，在克隆基因的272位，与GenBank中的序列不同，由C变为T。GenBank数据库中已经提及这种变化，认为可能是等位基因的缘故。

图1RT-PCR扩增的CTLA4基因产物的电泳图谱

Fig 1 Electrophoresis of products of CTLA4 gene amplified by RT-PCR

1:PBR322/BstNI marker;2:CTLA4 gene;3:Extracellular domain of CTLA4

2.2CTLA4表达质粒的构建(图2)由于CTLA4基因的信号肽序列不明确，为表达该基因的胞外段，需要引入抑瘤素M的信号肽〔3〕，并为适合pIg质粒的要求，在胞外段下游引物P5中，引入了表达载体要求提供的剪切供体ACTTACCTGT。引物的序列如下：

P3:5′GGGGATATCCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGG-ACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC3′

P4:5′CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAGCATGGCG-AGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC3′

P5:5′GCGGATCCACTTACCTGTAGAATCTGGGCACGG3′

图2重组质粒pIg-CTLA4的构建

Fig2 Construction of recombinanat plasmid pIg-CTLA4

用P4和P5引物，经半套式PCR扩增后，再用P3和P5引物，做引物重叠PCR，对CTLA4基因改构，获得抑瘤素M信号肽和CTLA4胞外段的融合基因。回收该产物，将其连入载体pGEM中，经EcoRI酶切鉴定正确的重组质粒命名为pGEM-OMCTLA4。PCR产物经限制性内切酶EcoRV和BamHI酶切及电泳回收，连接至经相同酶切的表达载体pIg。该载体含有可融合的人IgG1Fc，并要求欲表达的基因含剪切供体，其自身带有剪切受体。经酶切鉴定后，命名为pIg-CTLA4（图3）。

图3重组质粒pGEM-OMCTLA4与pIg-CTLA4的酶切鉴定

Fig3 Restriction emzyme analysis of recombinant plasmid pGEM-OMCTLA4 and pIg-CTLA4

1: DNA Marker, λ DNA/Hind III； 2： pIg-CTLA4/Hind III和 BamH I; 3:pGEM-OMCTLA4/EcoR I.

2.3CTLA4基因的表达及表达产物的鉴定提取重组质粒pIg-CTLA4，转染COS7和CHO-K细胞。提取转染并经G418筛选的细胞基因组DNA，通过PCR扩增表明，确实将pIg-CTLA4转入表达细胞。收集表达上清，用抗人IgGFcmAb和抗人CTLA4mAb，通过免疫印迹证明，在暂时性表达载体pIg中获得表达(图4)。

图4CTLA4-Ig表达产物的免疫印迹鉴定

Fig 4 Western blot analysis of CTLA4-Ig ecpression product

A:IgG Fc assay using anti-IgG Fc mAb; B:CTLA4 assay using anti-CTLA4 mAb;1,2:Supernatant of cells<