设为首页
加入收藏
求医中医药网
www.qe.cn
站内搜索
中图号：Q78文献标识码:A
文章编号:1007－8738（2000）01－0010－13
Construction,identification and expression of angiostatin K(1-3) gene eukaryotic expression vector
WU Jing-wenZHANG XiangGAO Da-kuanYI Li-hnuaLIU Xian-zhenWANG Xuan
（Institute of Neurosurgery of Chinese PLA, Xijing Hospital, ）
CHAI Yu-bo
（Department of Biochemistry and Molecular Biology, Fourth Military Medical University, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China）
Abstract:Aim To construct eukaryotic expression vector carrying human angiostatin K(1-3)cDNA and be expressed in cultured gliomas cells. Methods Angiostatin K(1-3) cDNA with secretive signal was cloned into polylinker site of eukaryotic expression vector pcDNA3 to construct pcDNA-SAK(1-3)， in which the transcription of angiostatin K(1-3) cDNA was driven by CMV promoter; and angiostatin K(1-3) cDNA was identified by restriction enzyme digestion. The vector was transfected into glioma cells,SHG44. The expressed angiostatin K(1-3) protein was identified by electron microscopy and FCM. Its activity was examined by the bovine micrangium endotheliocyte inhibition test. Results The eukaryotic expression vector pcDNA-SAK(1-3) was successfully constructed and transfected into glioma cells. The angiostatin K(1-3) protein, which can inhibit endothelial cells proliferation, was obtained. Conclusion The eukaryotic expression vector of functional angiostatin K(1-3) gene is acquired. The vector is of significance for human gliomas－ specific gene therapy.
Keywords:angiostatin K(1-3);eukaryotic expression vector; construction;gliomas;expression
抗血管生成基因治疗是指应用基因表达与调控等手段抑制实体瘤的血管生长，切断肿瘤的营养供给，对肿瘤采取饥饿疗法，从而达到治疗肿瘤的目的。近年来，脑胶质瘤的抗血管生成基因治疗受到高度重视，原因在于胶质瘤具有高度的异质性和遗传突变性，这些特点严重影响了针对肿瘤细胞的化疗、放疗和抑癌基因治疗的有效作用；而脑胶质瘤因富含血管，且其血管内皮细胞的遗传性相对稳定，因此，采用针对肿瘤新生血管内皮细胞的基因治疗具有较大的优势。在这方面的研究中，血管抑素(angiostatin)是最新发现的强有力的新生血管内皮细胞生成的抑制剂，能够抑制体内多种实体瘤的生长，已显示出广阔的临床应用前景[1,2]。AngiostatinK(1-3)，以下简称AK(1-3)，是纤维蛋白溶酶原N端的前3个kringles片段，具有较强地抑制血管内皮细胞增殖的活性[3]（图1）。在以往的研究中，我们克隆了AK(1-3)基因，并在此基础上，我们将该基因构建在真核表达载体上，转染入体外培养的胶质瘤细胞(SHG44)，获得了具有功能活性的AK(1-3)表达蛋白，为脑胶质瘤的抗血管生成的基因治疗奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 真核表达载体pcDNA3由本校生化教研室提供，目的基因为本室克隆所得，共916 bp。其中前57 bp为编码19个氨基酸的分泌信号肽序列，后859 bp为编码约280～286个氨基酸的AK(13)基因序列。该目的基因具有EcoR I和Xba I的酶切位点。其质粒pSAK(1-3)为本室保存。宿主菌E.Coli DH5α，EcoR I, Xba I, T4 DNA ligase，分别购自Promega公司和Gibco公司。兔抗人plasminogen单克隆抗体(mAb)购自American Diagnostic Company。细胞培养基RPMI 1640和胎牛血清为Gibco公司产品。脂质体(lipofectamine)和G418购自Sigma公司。PCR pure kit为Clontech公司产品。Plasmid purification kit为上海华顺公司产品。
1.2 方法
1.2.1 pcDNA-SAK(1-3)的构建 [4] 将1 μg质粒pSAK(1-3)以EcoR I和Xba I 双酶切，电泳回收目的基因片段并将其重溶于20 μL TE中；另将0.5 μg pcDNA3以上述酶双酶切，电泳回收载体片段, 并溶于20 μL TE中。连接时取1 μL pcDNA3和5μL目的基因片段，以1∶5的分子比将二者相连接，转化DH5α，接种于含Amp琼脂平板上，培养后长出约90个克隆。
1.2.2 pcDNA-SAK(1-3)的鉴定 随机选取上述8个克隆，小量提取质粒，以EcoR I和Xba I双酶切鉴定，切除约916 bp的克隆(阳性克隆)。将阳性克隆扩大培养，提取重组质粒，并将含有AK(13)基因的重组质粒命名为pcDNA-SAK(1-3)(图1)。将上述重组质粒大量扩增，以碱裂解法大量提取质粒，进行纯化和质粒定量，保存于－20℃备用。
1.2.3 pcDNA-SAK(1-3)基因的转染 参照lipofectamine说明书进行。经G418抗性筛选2 wk后，应用单细胞显微镜操作法，挑取单个阳性克隆，继续在G418抗性培养液中筛选2 wk。将筛选转染成功的细胞扩大培养后，收集培养上清备用。上述转染细胞的后续培养始终在G418的筛选压力下进行，以防转入基因的丢失。
1.2.4 AK(1-3)对血管内皮细胞增殖的抑制作用
将体外分离的原代牛微血管内皮细胞培养于含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液中，每4 ～5 d传代1次。传至第4代时，将内皮细胞(103/孔)接种于96孔板，置37℃ 50 mL/L CO2培养4 h～6 h。贴壁后弃上清，加入以100 mL/L胎牛血清 RPMI1640稀释成不同浓度[含AK(1－3)蛋白的]瘤细胞上清(200 μL/孔)。60 h后，加入MTT(5 g/L，20 μL/孔)，继续孵育4 h，小心吸去上清，加入DMSO(150 μL/孔)，充分震荡10 min，于酶联免疫检测仪上读取490 nm的A值。
1.2.5 AK(1－3)表达的鉴定 将SHG44细胞和转染pcDNA3和pcDNA－SAK(1－3)的SHG44细胞(各约3×106)，用无血清RPMI 1640培养液洗涤2次，用2.5 g/L胰酶消化后，离心1 800 r/min×10 min，沿管壁倒入20 mL/L戊二醛2 mL，固定2 h后，观察细胞的超微结构。免疫荧光法鉴定中，所用一抗为兔抗人纤溶酶原的mAb，(对照组加羊血清)，二抗为荧光素标记的鼠抗兔抗体。将上述3组细胞用胰蛋白酶消化制成单细胞悬液(1×106)，PBS洗两次，加入40 mL/L多聚甲醛固定40 min，离心、弃上清，悬于200 μL含100 mL/L小羊血清的1mL/L Triton X中。37℃作用1h后，PBS洗两次，依次加入100 μL 1∶50的一抗和1∶100荧光素标记的二抗(期间均同上作用及洗涤)，最后用PBS稀释至总量为400 μL后送检。
2 结 果
2.1 pcDNA-SAK(1-3)的酶切鉴定 上述重组质粒扩大培养后，提取重组质粒进行EcoR I和Xba I双酶切鉴定，结果见图1。
图1 质粒pcDNA-SAK(1-3)的双酶切鉴定
Fig 1 Restriction enzyme analysis of plasmid pcDNA-SAK(1-3)
A，B:pcDNA-SAK(1-3)cut with EcoR I and Xba I;C:λDNA/Hind III marker(from top to bottom23130,9416,6557,4361,2322,2027 and 564 bp).
2.2 AK(1-3)对血管内皮细胞增殖的抑制作用
取转染与未转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞培养上清，经紫外分光光度计测定蛋白量后，加入体外原代培养的牛微血管内皮细胞中，用MTT法检测其抑制血管内皮细胞增殖的作用。转染pcDNA-SAK(1-3)的瘤细胞的表达产物对体外培养的牛微血管内皮细胞的增殖有明显地抑制作用，且呈剂量依赖的效应，即随AK(1-3)剂量的增加，对贴壁内皮细胞生长的抑制作用逐渐增强，镜下观察可见细胞脱落飘浮、甚至死亡(图2)，而对未转染组内皮细胞的生长则无抑制作用。
2.3 电镜和免疫荧光检测 转染和未转染pcDNA-SAK(1-3)的胶质瘤细胞(SHG44)，均表现为胞核增大，甚至出现多核现象，胞浆较少、内质网扩张和线粒体增大等。但转染pcDNA-SAK(1-3)的SHG44细胞胞浆中有分泌颗粒存在，见(图3)中的箭头所示。转染细胞的免疫荧光检测可见有AK(1-3)表达。其中A 组：未转染的SHG44细胞，加一抗兔抗人纤溶酶原mAb；B组：未转染的SHG44细胞，加羊血清代替一抗；C和D组：分别为转染空载体和转染pcDAN-SAK(1-3)的SHG44细胞，加一抗兔抗人纤溶酶原mAb。
