中国图书资料分类号：R392.12

Role of CD4^＋T cells in mucosal immune respones of mice after oral

immunization with the bivalent Shigella vaccine candidates

Zhang Ya dong,Gao Jie ying,Peng Hong,Xing Li,Zeng Guan fu

(Laboratory of Immunology, Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences ,Beijing 100850)

Keywords：CD4^＋Tcellscell proliferationanti-L3T4 mAbShigella vaccine

Abstract：After the mice were orally immunized with live attenuated bivalent hybrid strain FS－5416 of S.flexneri 2a and S.sonnei,the role of CD4^＋ T cells in Peyer's patches was studied by T cell proliferation assay in vitro and Ig isotype-specific BA-ELISPOT assay following selective depletion of CD4^＋T cells with monoclonal anti－L3T4 mAb.The CD4^＋T cells in peyer's patches produced strong proliferation respones after oral immunization,and anti-L3T4 mAb treatment weekly resulted in a significant decrease of the antigen-specific lg-producing cells compared with controls.These results indicate a important role of CD4^＋T cells in mucosal immune responses.

肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues,GALT)的组成部分PP结（Peyer,s patches),是肠粘膜免疫系统的重要诱导部位，含有参与免疫应答的各种免疫细胞，如CD4^＋T细胞、CD8^＋T细胞、B细胞和APC（Mφ，DC）等^〔1〕。本室以往研究证实，小鼠口服F2a痢疾杆菌或痢疾疫苗免疫后，PP结中CD4^＋T细胞亚群比例升高，并发现CD4^＋T细胞对痢疾疫苗蛋白及LPS等抗原成分均可产生显著的特异性增殖反应，提示CD4^＋T细胞参与了小鼠肠粘膜对痢疾杆菌或其疫苗的免疫应答^〔2～4〕。本文以小鼠为模型，应用本室构建的双价痢疾候选疫苗FS-5416作为免疫原，检测了小鼠PP结中CD^＋T细胞的抗原特异性增殖反应，并观察了选择性地删除小鼠体内CD4^＋T细胞后，对肠粘膜产生特异性Ig分泌细胞的影响，进一步探讨了CD4^＋T细胞在小鼠肠粘膜免疫应答中的作用。

1材料和方法

1.1抗原双价痢疾候选疫苗FS-5416，由本室构建。其特点是，表达福氏2a与宋内氏痢疾杆菌双价O抗原和几种侵袭性相关蛋白IpaA,IpaB,IpaC及IpaD等，具有接触性溶血活性，能侵入Hela细胞。

1.2实验动物与免疫方案Balb/c小鼠，6周～8周龄，由本院实验动物中心提供。实验组小鼠经口灌服FS-5416菌5×10⁹/0.5ml(细菌浓度按中国细菌浊度标准用目测法确定)，共免疫2～3次，间隔1周；对照组小鼠经口灌服生理盐水。

1.3抗原特异性T细胞增殖试验参照文献〔4〕进行。简言之，将FS-5416菌超声粉碎，与聚苯乙烯乳珠(polystyrene latex beds,Sigma,LB-11)偶联^〔5〕，作为刺激T细胞的特异性抗原。以乳珠∶细胞=10∶1的比例，与分离自小鼠肠道PP结及脾脏中的CD4^＋T细胞或CD8^＋T细胞混合^〔6〕(CD4^＋T与CD8^＋T细胞的纯度为94％～98％)，再加入脾脏滋养细胞(以抗Thy1.2mAb加豚鼠补体去除T细胞，并用丝裂霉素预处理)^〔7〕。在37℃、7％CO₂孵箱中共培养8d。终止培养前3h，用MTT法^〔8〕选择检测波长570nm、参考波长630nm测定光吸度(A)值。

1.4anti-L3T4mAb的处理^〔9〕实验组小鼠于免疫前2d，以1mg抗L3T4 mAb(杂交瘤引自ATCC，mAb腹水自制)腹腔注射，以后每周同法处理1次，共3次。用间接免疫荧光染色法，检测PP结及脾脏中CD4^＋T细胞的动态变化。

1.5BA-ELISPOT法检测Ig分泌细胞参照文献〔10〕进行。小鼠末次免疫后第5天，常规制备PP或脾脏细胞悬液，加入以超声粉碎法制备的FS-5416抗原(100mg/L)预包被的96孔培养板中，1×10⁵细胞/孔；37℃、5％CO₂静止孵育4h后，弃去细胞悬液，分别加入Bio-羊抗小鼠IgA、IgM或IgG，再依次加入Avidin-HRP及底物缓冲液(0.1％TMB，7.5％明胶，0.03％H₂O₂,pH5.0)，于显微镜下检测每孔的蓝色小斑点数。

2结果

2.1淋巴细胞的特异性增殖反应①如图1所示，与未免疫的对照小鼠相比较，口服免疫后小鼠肠粘膜PP结的CD4^＋T细胞，对FS-5416抗原的增殖反应显著增强(P＜0.01),而脾脏的CD4^＋T细胞则未产生明显的增殖反应(P＞0.05)，与本室以往的研究报道相一致^〔4〕。②如图2所示，与未免疫的对照小鼠相比较，口服免疫后小鼠肠粘膜PP结与脾脏的CD8^＋T细胞，对FS-5416抗原的增殖反应均不明显(P＞0.05)。

图1CD4^＋T细胞对FS-5416的增殖反应

Fig1Proliferative response of CD₄^＋T cells to Fs-5416

* P ＜0.01 vs control group

图2CD8^＋T细胞对FS-5416的增殖反应

Fig2Proliferative response of CD₈^＋T cells to Fs-5416

2.2mAb处理后PP结及脾脏CD4^＋T细胞的动态变化小鼠首次腹腔注射抗L3T4mAb后第2天，PP结及脾脏中CD4^＋T细胞的数量即迅速下降，阳性率＜1%；而在以后的两次注射抗L3T4mAb期间，均未见CD4^＋T细胞数回升。每周腹腔注射1次抗L3T4 mAb，即可达到选择性地删除小鼠体内CD4^＋T细胞的目的。

2.3特异性Ig分泌细胞的比较如图3,4所示：①注射mAb组较未注射mAb组口服痢疾疫苗后，PP结中产生的FS-5416抗原特异性IgA，IgM和IgG分泌细胞明显减少(P＜0.01),与对照组小鼠相比较无明显差异(P＞0.05);表明小鼠肠粘膜无抗原特异性Ig分泌细胞产生，并提示选择性地删除CD4^＋T细胞后，肠粘膜对口服痢疾疫苗未产生有效的免疫应答。②注射mAb组较未注射mAb组口服痢疾疫苗后，脾脏中产生的FS-5416抗原特异性IgM和IgG(IgA除外)分泌细胞数明显减少(P＜0.01)，与对照组小鼠相比较也无明显差异(P＞0.05)，提示CD4^＋T细胞的选择性删除，也可抑制小鼠全身免疫系统的应答反应。

图3痢疾菌苗免疫后3组小鼠PP结中抗原特异性Ig分泌细胞的比较

Fig3Frequencies of Ig-producing cells in Peyer's patches among

three groups of mice orally immunized with FS-5416

*P＜0.01 vs control group

图4痢疾菌苗免疫后3组小鼠脾脏中抗原特异性Ig分泌细胞的比较

Fig4Frequencies of Ig-producing cells in spleen among three groups of

mice orally immunized with FS-5416

*P＜0.01 vs control group

3讨论

粘膜免疫系统包括诱导部位和效应部位。效应部位免疫应答的性质在很大程度上取决于抗原与诱导部位的相互作用，而PP结则是痢疾杆菌诱导肠粘膜免疫应答的关键部位^〔11〕。本文的研究结果表明：①PP结中的CD4^＋T细胞对痢疾疫苗抗原可产生显著的增殖反应，提示PP结中CD4^＋T细胞的特异性活化可能与肠粘膜免疫应答的诱导有关。②mAb选择性地删除CD4^＋T细胞后，小鼠肠粘膜对口服痢疾疫苗不能产生有效的免疫应答，提示小鼠肠粘膜免疫应答的产生必需有CD4^＋T细胞的参与。③PP结中的CD8^＋T细胞可能未参与肠粘膜免疫应答的诱导阶段。④口服痢疾疫苗可诱导小鼠肠粘膜产生免疫应答，但不能诱导其脾脏等免疫器官产生明显的应答，从而证实机体免疫应答的性质受到抗原免疫途径的影响。

与此同时，我们从细胞表型和细胞因子mRNA表达水平两个方面，对痢疾疫苗免疫后小鼠肠粘膜免疫诱导部位Th1/Th2型细胞亚群的变化进行了研究，发现Th1和Th2型细胞亚群都参与了肠粘膜对痢疾疫苗免疫应答的调节(结果另文报告)。上述研究结果为探讨CD4^＋T细胞在肠粘膜免疫应答中的作用提供了线索，对于研究痢疾疫苗的免疫保护机制及痢疾疫苗的改建亦具