摘要利用全套噬菌体抗体表面展示技术，绕过杂交瘤技术，从重组人G－CSF免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA后，用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链可变区（VH和VL）基因的扩增。经重叠延伸反应，在体外随机装配成单链抗体（ScFv）。将其克隆至噬菌粒载体pCANTAB5E中，电转化含SupE的E.coli菌株，以辅助噬菌体M13KO7超感染噬菌粒文库，构建成全套ScFv表面展示文库。为利用亲和富集筛选技术，获得具有G－CSF结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。

中国图书资料分类号R392.11Q78

Construction of a phage display library of repertoire single－chain Fv antibodies from mouse immunized with recombinant human granulocytecolony－stimulating factor (G－CSF)

Jia Songhui , Guo Yao1 (Department of Pathophysiology, 1Department of Radiation Medicine, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032) Fan Lingzhi, Liang Mifang, Hou Yunde (National Laboratory of Molecular Virology and Genetic Engineering, Chinese Academy Preventive Medicine)

Keywords G－CSF single－chain Fv antibody phage display cDNA library

Abstract Using phage display technique we constructed a library of repertoire immunoglobulin from mouse immunized with recombinant human granulocytecolony-stimulating factor (G－CSF). The heavy-chain and kappa light－chain variable region gene (VH and VL) repertoire of immunoglobulin were amplified individually from the spleen cell mRNA by RT－PCR and joined by a DNA linker encoding peptide (GGGGS)3 as a single chain Fv (ScFv) DNA fragment with overlap extension. These fragments were cloned into the phagemid pCANTAB 5E and expressed as a fusion protein with phage M13 PⅢ in E.coli TG1.In the presence of helper phage M13KO7, the ScFv fusion protein were displayed on the surface of recombinant phages.

粒系集落刺激因子（G－CSF）具有特异地刺激和调节粒细胞系统增殖、分化、存活和活化等作用^〔1〕，在放射损伤的救治及肿瘤患者放、化疗的辅助治疗等方面具有重要作用。但由于嗜中性粒细胞在组织内的大量聚积和激活，可通过“呼吸爆发”效应释放出大量氧自由基等多种成分，在清除异己的同时也将对自身组织产生严重损伤。这已成为多器官功能衰竭、成人呼吸窘迫综合征及全身性炎症反应综合征等严重病理过程的一个重要机制^〔2〕。因此，保持体内粒细胞的动态平衡是对一些临床疾病诊治的重要环节。由于粒细胞的激活和释放反应受多种因素（包括多种细胞因子）的影响和调节^〔3〕，而G－CSF则能够特异性地刺激和调节粒细胞系统的增殖和活化，因此，研究其在炎性─抗炎性细胞因子网络中的作用及地位就十分必要。其中研制和应用抗G－CSF抗体将是一个重要的途径。本实验利用90年代发展起来的全套抗体噬菌体表面展示系

统^〔4〕，绕过杂交瘤技术，从重组人G－CSF免疫小鼠脾淋巴细胞mRNA出发，利用重叠延伸反应在体外随机拼接抗体可变区基因，最终构建了全套单链抗体（ScFv）噬菌体表面展示文库，为利用亲和富集筛选技术，获得具有G－CSF结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1噬菌粒载体及辅助噬菌体噬菌粒载体pCANTAB5E，为Pharmacia公司产品。其中含有氨苄抗性基因（Ampr）,Plac启动子及M13噬菌体间隔区片段,用于克隆ScFv基因的SfiⅠ，NotⅠ克隆位点及Etag序列和瑚珀终止码TAG。辅助噬菌体M13KO7，为Pharmacia公司产品，带有突变型基因Ⅱ、质粒复制起点和卡那霉素抗性基因（Kanr）,在其辅助下可使前者产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒。细菌菌株E.coliTG1为Pharmacia公司产品，用于ScFv噬菌体表面展示。

1.1.2PCR反应系统TagDNA聚合酶和dNTP,为德国Boehringer Mannheim产品；PCR引物为Pharmacia产品，其中①Heavy－chain primer1和2分别为V_H基因5＇端和3＇端引物，用来扩增鼠IgVH基因。②Light－chain primer mix为10种V_L基因5＇端和3＇端引物的混合物，用来扩增鼠IgVL基因。③Linker primer mix为含有两条互补、各有93个碱基序列、带有Linker(GGGGS)3序列的VH基因3＇端和VL基因5＇端引物的等摩尔数混合物。该引物两端的各24个碱基分别与V_H和V_L基因的3＇端和5＇端相互补，从而可将V_H和V_L基因片段拼接成ScFv基因。④RS primer mix为带有SfiⅠ位点的重链基因5＇端引物和带有NotⅠ位点的轻链基因3＇端引物的混合物，用来扩增ScFv基因片段同时引入克隆位点。

1.1.3试剂TRIzol试剂、cDNA合成试剂及各种限制性核酸内切酶等,分别为Boehringer Mannheim公司、Pharmacia公司、Biolabs公司、Life Technologies公司或华美公司产品；G-CSF为军事医学科学院邦定公司产品（纯度大于95％且不含白蛋白保护剂）。

1.2方法

1.2.1动物免疫出生后6周龄雌性Balb/c小鼠10只（中国医学科学院动物繁育场提供）体重17g～20g，适应性饲养1周后，随机分为5组，每组2只。分别以5μg，10μg，20μg和50μg等不同剂量G－CSF加福氏完全佐剂（等体积）进行初次免疫。对照组以生理盐水代替G－CSF。3周后进行第2次免疫，以G－CSF（剂量同前）加福氏不完全佐剂（等体积）皮下多点注射。第6周时进行第3次免疫，以G－CSF（剂量同前）不加佐剂腹腔注射。第7周时，取小鼠血清以常规ELISA法检测抗体滴度。滴度达1∶10000后，立刻进行第4次免疫，以加倍剂量的G－CSF不加佐剂腹腔注射。第8周以G－CSF（剂量同前）进行加强免疫，不加佐剂腹腔注射，连续免疫3d。

1.2.2小鼠脾细胞总RNA的提取加强免疫结束后，取免疫效果较好的小鼠1只立即处死，迅速取出脾脏，按TRIzol试剂说明书要求提取细胞总RNA。

1.2.3逆转录合成cDNA第1条链参照Boehringer Mannheim公司的逆转录系统产品说明书，以总RNA为模板，OligodT(15)为引物，在逆转录酶的催化下合成cDNA第1条链。

1.2.4全套V_H和V_L基因的扩增以逆转录合成的cDNA第1条链为模板，按下列体系分别进行全套V_H和V_L基因的扩增。扩增全套V_H基因：模板5μl,Heavy-chain primer1和Heavy-chainprimer2各1μl,dNTP(2.5mmol/每种核苷酸·L)4μl,10×PCR缓冲液5μl,无菌双蒸水33μl。于100℃预变性5min,0℃冰浴5min后,加TagDNA聚合酶5U(1μl)。扩增全套V_L基因:除应用Light－chain primer mix2ml代替上述引物外，其它均相同。PCR反应参数为：94℃45s,55℃1min,72℃1min,30个循环后，72℃延伸10min。将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，用MicroSpin columns柱回收目的基因片段。

1.2.5全套V_H，V_L基因的随机拼接纯化回收的V_H，V_L基因片段，用V_Hmarker在紫外灯下定量分析后，与Linker primer mix以相同或接近等摩尔浓度混合，按下列体系进行连接PCR反应：纯化VH和VL基因的PCR产物各50ng,Linker primer mix4μl,10×PCR缓冲液5μl,dNTP(10mmol/每种核苷酸·L)4μl,以无菌双蒸水补充至总体积为50μl。100℃预变性5min,0℃冰浴5min后,加TagDNA聚合酶5U(1μl)。PCR反应的参数为:94℃1min,63℃4min，循环7次后延伸5min,从而将全套VH,VL基因随机拼接成ScFv。

1.2.6 全套ScFv基因的第2次PCR扩增 准备下列反应体系：TagDNA聚合酶5U(1μl)，10×PCR缓冲液5μl，dNTP(10mmol/每种核苷酸·L)2μl，RSprimermix4μl，无菌双蒸水38μl。将上述反应体系加入7次循环后的PCR管内，继续进行30次循环。循环条件为:94℃1min,55℃1min又30s,72℃2min。循环结束后,72℃延伸10min。

1.2.7全套ScFv基因的克隆将第2次PCR扩增产物加至含有SephacrylS－400HR树脂的MicroSpincolumn柱内进行回收。对所获纯化的ScFv基因片段用SfiⅠ和NotⅠ消化，再次用相同方法纯化回收。经用ScFvmarker定量分析后，将全套ScFv基因片段与pCANTAB5E载体在T4DNA连接酶(5U～7U)作用下进行连接。同时做载体自连和阳性插入(controlinsert)。制备电转化的E.coliTG₁感受态细胞。取2μl连接产物加入100μl电转化的感受态菌液中,在E.colipulser电转化仪中进行转化。将转化产物加入至37℃预温的1mlSOC培养液中，温浴1h后，取100μl涂于SOBAG（含有100mg/L氨苄青霉素和2％葡萄糖的SOB培养基）琼脂板上，30℃培养24h。

1.2.8全套ScFv基因的噬菌体表面展示及鉴定从生长良好的SOBAG平皿上,挑取22个单菌落快提质粒进行酶切鉴定后，用2×YTAG（含有100mg/L氨苄青霉素和2％葡萄糖的2×YT培养基）5ml将板上所有菌落洗下。取部分菌液用2×YTAG10ml稀释至A600为0.2后，于37℃振荡培养

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