同济医科大学学报2000年第29卷第4期

廖国宁雷景迈何善述

摘要：为使MTT比色法得到更广泛的应用，对紫外与可见光分光分析仪测定细胞增殖MTT比色法的实验条件进行了探索。结果发现：以5 mg/ml MTT 在0.1×10⁴～2.4×10⁴细胞范围内进行检测，可获得较好的线性检测结果(γ=0.9872)。与酶标仪直接测定比较，具有灵敏度高、数据准确、检测范围广，值得推广应用。

关键词：MTT比色法；细胞增殖

在细胞水平研究中，检测细胞增殖的常规方法有两种，即细胞计数法和同位素掺入法，这两种方法或因操作繁琐，不够准确或因使用放射性同位素，易污染环境，因而在实际工作中都有其局限性。1983年Mosmann首创用［3-（4，5-dimethylthiazolzyl）2，5-diphen yl tetrazolium bromide四甲基偶氮唑盐，MTT］经活细胞线粒体内脱氢酶催化还原产生甲（formazan）的颜色反应检测细胞增殖^［1］。因此法操作简便、快速、准确、廉价及不使用同位素等优点，现已用于生物医学的许多研究中。为了使MTT比色法得到更广泛的应用，我们对原方法做了一些改进，并用U-2000型紫外与可见光分光分析仪测定了肺动脉平滑肌细胞（PASMC）的增殖。

1材料与方法

1.1材料

MTT购自Fluka公司；二甲基亚砜（dimethyle sulfoxide，DMSO）、无血清培养基（serum- free medium，SFM）等购自Sigma公司；紫外与可见光分光分析仪（HITACHI u-2000型，日 本）。

1.2方法

将第三代PASMC稀释至不同密度，种于96孔板（150 μl /孔）培养24 h，弃去培养液，用PB S洗两次，每孔加入110 μl MTT反应液［含100μl SFM +10 μl MTT（5 mg/ml）］37 ℃ 、5% CO₂培养箱培养4 h，每孔吸取80μl培养液，加入100 μl DMSO，转入EP管，用DMS O稀释至310 μl，立即在U-2000型紫外与可见光分光分析仪(570 nm下读取A值。

2结果

2.1MTT甲溶液可见光区扫描吸收光谱

甲吸收峰位于570 nm附近，而MTT的吸收峰在380 nm。并且残留的SFM、 MTT及DMSO对测定均无影响。故选择测定波长为570 nm。

2.2检测范围

MTT甲是细胞能量代谢的反映，其生成量随细胞数的增多而增加，由图1可见，细胞数在0.1×10⁴～2.4×10⁴范围内与A值呈正相关，线性良好，其相关系数r=0.9872 ，MTT10 μl (5 mg/ml)基本能准确灵敏地反映对数生长期细胞增殖的情况。

图1MTT比色法吸光度（A）与细胞数(104）的关系

2.3 温育时间对甲月替生成的影响

A 值随温育时间增加而增高，实际测定时选取4 h，见图2。

图2保温时间对甲生成的影响

a. 1.5×10⁴细胞B. 0.5×10⁴细胞

2.4测定时间对稳定性的影响

由图3可见，2 h内测定对结果没有影响，2 h后测定结果偏高，提示测定最好在2 h内完成。

图3测定时间对稳定性的影响

a. 1.5×10⁴ 细胞B. 0.5×10⁴细胞

3讨论

MTT是一种淡黄色唑氮盐，是活细胞线粒体脱氢酶的底物，经酶催化还原为不溶于水的蓝紫色甲（formazan）结晶，该物质溶解后，在560～610 nm中有一个较宽的最大吸收峰，用分光分析仪可对其进行测量，其值与活细胞之间有良好的线性关系^［2］。有关MTT比色法的文献报道很多，但实验方法各有差异，一般可用酶标仪直接检测，若无酶标仪，也可用可见光分析仪进行检测。本实验对使用U-2000型紫外与可见光分光分析仪测定PASMC增殖的MTT比色 法进行了探索，并得到如下实验条件：（1）测定时换成含MTT的SFM以排除杂蛋白的干扰；（2）测定波长为570 nm；（3）37℃、5%CO₂条件，MTT温育4 h；（4）当温度较低时 （＜20℃），溶剂选用DMSO较好；（5）以5 mg/ml的MTT浓度在0.1×10⁴ ～ 2.4×10⁴的细胞数范围内，可获得较好的线性检测结果，相关系数r=0.9872。与用酶标仪直接测定比较，本法虽略显繁琐，但它具有细胞数范围广，灵敏度高、数据准确等优点，值得推广应用。

国家自然科学基金资助项目（No.39270295)

廖国宁，男，1962年生，博士研究生廖国宁（同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉430030)

雷景迈（同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉430030)

何善述（同济医科大学基础医学院生物化学教研室，武汉430030）

参考文献

1，Mosmaan T. Colorimetric assay cellular growth and survival：Applicat ion to proliferation and cytotoxity assays. J Immunol Methods，1983，65：55

2，薛彬，Edeman A，Thorbecke G J.介绍一种用颜色显示法测细胞的生长及增殖.北京医科大学学报，1987，19(2)：125