西安医科大学学报2000年第21卷第3期

姚红霞胡志华苏群豪陈志斌李淑萍柴玲

摘要：目的探讨非何杰金淋巴瘤(NHL)中P16基因缺失情况及其与组织亚型和治疗的关系。方法采用聚合酶链反应-单链构象多态银染技术(PCR-SSCP)检测29例非何杰金淋巴瘤患者P16基因的变化。结果29例非何杰金淋巴瘤中12例存在P16基因缺失，总缺失率41.3%；12例缺失中有6例在两个疗程化疗后缺失消失；高度恶性淋巴瘤缺失率高。结论P16基因缺失在NHL发病中起一定作用，其发生率与组织亚型和治疗效果有关。

关键词：非何杰金淋巴瘤；P16基因；缺失；组织亚型

淋巴瘤是常见的血液肿瘤，中国人以非何杰金淋巴瘤发病为主，其发生发展与癌基因的激活及抑癌基因的失活有关。P16基因是新发现的一种抑癌基因，因其在细胞周期调控中起重要作用而倍受重视。目前国内外对P16基因的分析着重在突变类型，而对其突变与组织亚型及治疗关系的观察尚少。为此，本研究应用聚合酶链反应-单链DNA构象多态分析(PCR-SSCP)观察了非何杰金淋巴瘤P16基因的变化。

1材料和方法

1.1病例及取材29例非何杰金淋巴瘤患者选自海南医学院及海南省人民医院，均经病理学及免疫学确诊。标本均在化疗前采取，对有突变病例于第2次化疗后复查P16基因，化疗方案为CHOP，疗程5d，每28d一个周期。正常对照组30例为健康体检者。

1.2检测方法

1.2.1DNA制备先分离提取单个核细胞，加SDS饱和氯化钠离心，加乙醇沉淀DNA。

1.2.2PCR扩增根据P16基因序列设计第2外显子1对引物，上游：5′ aGCAGCATG GAGCCTTCGGCT3′,下游：5′TTTGA ATTCAATCGGGGATGTCTG3′。引物由解放军基因研究所合成，扩增产物220bp。扩增体系：总反应体积30μl，模板DNA200ng，引物1μmol/L,Taq酶0.2μl。首次变性温度94℃ 1min，94℃35s、55℃45s、72℃50s，重复36个循环，72℃延伸3min，4℃终止反应。扩增产物于2.5%琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察结果。Marker为PBR322/HaeⅢ。

1.2.3SSCP和银染取20μl PCR扩增产物加2μl溴酚兰混合后煮沸5min，速置冰水混合物5min，加入8%聚丙稀酰胺凝胶电泳3h(电压120V)后银染：10%乙醇、1%硝酸各浸泡5min，冲洗，再放入染色液中浸泡10min后冲洗，加显色液5～10min出现条带后用乙酸终止反应。

2结果

2.1PCR扩增结果29例非何杰金淋巴瘤中P16基因缺失12例，缺失率占41.3%。见图1和图2。

图1PCR扩增结果

m：Marker；+：阳性对照；NHL：非何杰金淋巴瘤

图2PCR银染结果

m：Marker；N:正常对照；箭头示条带增多移位

2.2P16基因缺失与病理类型的关系29例非何杰金淋巴瘤中，低度恶性淋巴瘤13例，未见1例P16基因缺失(0/13)，高度恶性淋巴瘤16例，其中有10例缺失(10/16)，缺失率为62.5%。T细胞型淋巴瘤11例中有8例缺失(8/11)，缺失率72.7%，B细胞型淋巴瘤12例中有1例缺失(1/12)，缺失率8.3%。

2.3P16基因缺失与治疗效果的关系12例治疗前有P16基因缺失的病人，第二疗程联合化疗后有8例缺失消失，4例缺失存在。

3讨论

P16基因为细胞周期依赖激酶(CDK)抑制蛋白基因家族中率先被克隆的EcoRI,片段长度约23kb,由3个外显子组成^［1］，定位于染色体9p21区。细胞周期的正常演进依赖于周期蛋白(Cyclin)和抑制蛋白对CDK3的正负平衡调节作用。CyclinD与CDK4和CDK6结合，激活两者，导致PRb磷酸化，失去抑制转录因子启动DNA合成的作用，使细胞不能从G₁期进入S期。Cyclin激活过程可因P16蛋白与CDK4结合而受抑制，P16对CyclinD/CDK4抑制作用的消失，细胞发生异常增生形成肿瘤^［2］。

P16基因的功能失活形成主要包括基因的缺失、重排、突变和甲基化，其中以纯合缺失为主。P16在淋巴瘤中的不同亚型缺失率不同，总缺失率低于ALL，而高于其他造血系统肿瘤。Stranks^［3］观察了14例非何杰金淋巴瘤患者细胞中有6例存在P16基因缺失，其中3例病人经历了从低度恶性向高度恶性的转变。Neumeister^［4］用半定量PCR方法检测了胃肠型P16基因纯合缺失情况，发现在高度恶性淋巴瘤中缺失率达14%，而在低度恶性淋巴瘤中无缺失，认为P16基因缺失可能提示肿瘤从低度向高度恶性的转变。本组29例非何杰金淋巴瘤患者中有12例存在P16基因缺失，且高度恶性及B细胞型患者缺失率高，低度恶性淋巴瘤中未见缺失，与文献报道结果一致。Garcia^［5］采用southern杂交分析103例非何杰金淋巴瘤病人，有7例存在P16基因的改变，其中4例为纯合缺失，3例是基因重排，他还作了P16基因突变的生存分析，发现P16基因异常与生存缩短一致，认为在对肿瘤的多种分析中，P16基因的异常应列为和LDH、β2-MG一样影响预后的因素。本文进行治疗前后对比，治疗前缺失12例病人中，在第二疗程联合化疗后有8例消失，4例缺失仍存在，后者为联合化疗效果欠佳病人，也说明了P16基因与治疗效果及预后的关系。

基金项目：海南省自然科学基金资助项目(No.39613)

姚红霞（海南医学院附院血液科,海口570102)

胡志华（海南医学院附院血液科,海口570102)

苏群豪（海南医学院附院血液科,海口570102)

陈志斌（海南医学院附院血液科,海口570102)

李淑萍（海南医学院附院血液科,海口570102)

柴玲（海南医学院附院血液科,海口570102）

参考文献：

［1］赵温利，郭卫星，田志刚.肿瘤抑制基因P16的进展［J］.国外医学肿瘤学分册，1997，24(4)∶199

［2］ 刘明利.P16基因家族在血液系统恶性肿瘤中的研究新进展［J］.国外医学输血及血液学分册，1997，20(4)∶206

［3］Stranks G,Height SE,Mitchell P,et al.Deletion and rearrangement of CDKN in lymphoid maligance［J］.Blood ,1995，85(4)∶893

［4］Neumeister P, Hoefler G, Beham-Schmid S,et al.Deletion analysis of the p16 tumor suppressor gene in gastrointestinal mucosa associated lymphoid tissue lymphomas［J］.Gastrointerology,1997，112(6)∶1871

［5］ Garcia SR, Gonzalez M, Vargas M ,et al.Deletion and rerrangments of cyclin-dependent kinase 4 inhibitor gene p16 are associated with poor prognosis in B cell non-Hodgkin′s lymphomas［J］.Leukemia， 1997，11(11)∶1915