中华结核和呼吸杂志2000年第23卷第8期

吕斌符志军徐顺清陈志飞李开赏周宜开

摘要目的采用基因工程技术构建的可表达荧光素酶的结核分支杆菌噬菌体进行结核分支杆菌利福平药敏试验研究，建立一种特异、灵敏、快速的利福平药敏试验方法。方法采用生物发光方法分别检测重组分支杆菌噬菌体对不同细菌在不同浓度利福平培养基中的发光水平，并与罗氏培养基进行药敏试验比较。结果在不同细菌中，噬菌体均特异地对分支杆菌有发光反应，分支杆菌的发光值与大肠杆菌相比差异有显著性，而大肠杆菌的发光值与阴性对照差异无显著性（P＞0.05）；在各分支杆菌中，BCG的发光值最高，mc155次之，结核分支杆菌最低。在含利福平的培养基中，耐药结核分支杆菌的发光强度比非耐药结核分支杆菌强，其强度差异有显著性（P＜0.05）；通过对不同浓度利福平进行筛选试验，得出最适于利福平药敏试验的利福平浓度为2μg/ml；采用该浓度的利福平对结核分支杆菌标准株和临床分离株进行药敏试验，结果与罗氏培养法的结果一致。温敏噬菌体Phage88的检测灵敏度在各种分支杆菌中均大于正常噬菌体Phage 40，差异有显著性（P＜0.05）。结论重组噬菌体可特异地检测结核分支杆菌利福平耐药性，灵敏度高，可在72 h内得到结果，Phage 88的效果优于Phage 40，采用温敏株可提高检测的灵敏度和特异性。

关键词：分支杆菌噬菌体；利福平；药敏试验；分支杆菌，结核

近年的监测发现结核病的发病率及死亡率在全球范围内均有上升的趋势，同时耐药菌株的感染增加，给结核病的防治带来了很大的困难。利福平(R)是最常用的一线抗结核药，研究表明对利福平耐药的分支杆菌常常对其它抗结核药耐药。由于常规结核分支杆菌检测和药物敏感试验方法需6～12周，无法给临床提供及时、准确的用药参考，因此如何缩短药物敏感试验时间、提高检测的敏感性和特异性，已引起国内外学者关注。我们采用两株重组的可表达荧光素酶结核分支杆菌噬菌体，建立一种简便、快速、灵敏的结核分支杆菌利福平药敏试验方法。

材料与方法

一、材料

卡介苗（BCG）购自卫生部上海生物制品研究所。结核分支杆菌H₃₇Ra（ATCC25177）和结核分支杆菌H₃₇Rv（ATCC36801）购自中国药品生物制品检定所。耻垢分支杆菌(M.smegmatis)（ATCC19420）和大肠杆菌（Escherichia coli）（ATCC25922）分别由同济医科大学分子生物学教研室和微生物学教研室提供。本实验用分支杆菌噬菌体Phage40和Phage 88由Albert Einstein大学的William Jacobs 教授提供。

二、方法

1．细菌培养： BCG及缓慢生长分支杆菌在M7H9培养基中培养，耻垢分支杆菌等快速生长分支杆菌在Suton培养基中培养，大肠杆菌在普通琼脂培养基中培养。细菌浓度采用722分光光度计测量，吸光度(A)=1时的细菌数约为2×10⁹个。同时用倒置显微镜进行微菌落计数。

2．分支杆菌噬菌体的增殖与分离：分支杆菌噬菌体在耻垢分支杆菌中增殖。噬菌体加入Suton培养液，继续培养一段时间后终止培养，用赛氏漏斗过滤（采用0.45μm滤膜），保存滤液。或用固体苦味酸培养基，在噬菌斑出现后用噬菌斑裂解液裂解后收集裂解液，0.45μm滤膜过滤，用氯化铯30 000 g进行梯度离心纯化。

3.分支杆菌噬菌体的计数：将分支杆菌噬菌体浓缩液先进行一系列10倍梯度稀释后加入在苦味酸培养基中生长的耻垢分支杆菌菌苔中，培养48 h观察噬菌斑并计算噬斑形成单位数（PFU）。

4.发光分析：虫荧光素（luciferin，德国BM公司，纯度为99%）临用前用Tris（pH 7.8）缓冲液配制成相应浓度。细菌离心后用M7H9培养液洗2次，然后重浮在原体积的培养液中，孵育过夜。1 ml菌液中加入10³ PFU/ml的分支杆菌噬菌体1 ml孵育24 h后，取100μl样品于13 mm×75 mm的聚苯乙烯试管中，在最佳发光条件下（0.22 mmol/L荧光素 100 μl，0.1 mmol/L ATP 100 μl，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液100μl），LKB-1251发光仪中测量30 h内发光值。

5.发光分析测定各种细菌的耐药性：标准菌株及分离株采用Mcfarland3.0浊度（细菌浓度10⁷ CFU/ml），洗后重浮于2 ml培养液中，加入不含Tween80的含利福平及不含利福平M7H9培养基中37 ℃培养24 h，加入10³滴度的相应噬菌体孵育24 h后测量发光值。含利福平培养基的配制为在M7H9培养基中加入相应浓度的利福平组成，同时测定不同的利福平浓度梯度对临床分离耐药株及标准株的作用曲线。阴性对照采用标准药敏株H₃₇Ra减毒株，阳性对照采用标准耐药株H₃₇Rv强毒株。

6.测量和统计方法：每个因素做3管测发光值，每个值重复2次，每次发光测量测6 s的积分发光值。结果取均数±标准差表示，统计分析采用t检验。

结果

一、两种噬菌体对不同细菌的发光分析

用两种噬菌体分别对大肠杆菌、BCG、耻垢分支杆菌、结核分支杆菌菌株H₃₇Ra和H₃₇Rv进行了发光检测，结果表明：两株噬菌体对分支杆菌有特异性，非分支杆菌的大肠杆菌发光值很低，与阴性对照相比差异无显著性（P＞0.05），各种分支杆菌的发光值均较高，与阴性对照相比差异均有显著性（P＜0.05）。用Phage40检测分支杆菌时，发光值均在加入发光液后逐步上升，4 h左右达到最高值，以后逐步下降，在15 h后发光基本消失，所有分支杆菌的发光动力学过程都基本相似，但发光值有所不同，其中BCG的发光值最高，最高值约为阴性对照的100倍；耻垢分支杆菌次之，最高值约为阴性对照的70倍；结核分支杆菌最低，H₃₇Ra和H₃₇Rv的最高发光值约为阴性对照的25倍。用Phage 88检测分支杆菌时，发光值均在加入发光液后13 h左右达到最高值，以后逐步下降，在30 h后发光基本消失，所有分支杆菌的发光动力学过程都基本相似，但发光值有所不同，其中BCG的发光值最高，约为阴性对照的200倍；耻垢分支杆菌次之，最高值约为阴性对照的150倍；结核分支杆菌最低，H₃₇Ra和H₃₇Rv约为阴性对照的50倍。

二、进行药敏试验的利福平浓度筛选

为确定最佳的药敏试验浓度，采用系列梯度稀释的利福平对药敏株和耐药株进行发光分析，结果发现药敏株和耐药株在含不同浓度利福平培养基中的发光反应明显不同。Phage40在发光反应开始后4 h达到最高值，此时阳性对照H₃₇Rv为94.3 mV，耐药株在利福平浓度0.5 μg/ml时为84.95 mV，1 μg/ml时为80.45 mV，2 μg/ml时为76.34 mV；药敏株在0.5 μg/ml时为36.37 mV，1 μg/ml时为15.16 mV，2 μg/ml时为5.118 mV，与阴性对照H₃₇Ra相比（0.544 mV）差别小于10 mV。Phage88在发光反应开始后14 h达到最高值，此时阳性对照H₃₇Rv为271.3 mV，耐药株在利福平浓度0.5 μg/ml时为250.4 mV，1 μg/ml时为241.5 mV，2 μg/ml时为234.1 mV；药敏株在反应后12 h达到最高发光值，在利福平0.5μg/ml时为146.3 mV ，1 μg/ml时为80.34 mV，2 μg/ml时为5.033 mV，与阴性对照H₃₇Ra（0.537 mV）相比差别小于10 mV。可见耐药株在含利福平培养基中的发光值与阳性对照比较，差异无显著性（P＞0.05），而药敏株的发光值则随利福平浓度的升高而明显降低，差异有显著性（P＜0.001），在利福平2μg/ml浓度时药敏株的发光值与阴性对照已无明显区别（P＞0.05），而耐药株的发光值未受显著性影响。通过该系列药物浓度的筛选试验，得到最适于利福平药敏试验的浓度为2μg/ml。在该浓度下可通过发光值明显区别药敏株和耐药株。

三、两种噬菌体对不同分支杆菌的利福平药敏试验结果

为判定噬菌体生物发光技术对不同分支杆菌的药敏试验的可行性及确定最佳实验条件，采用2μg/ml利福平浓度对不同的噬菌体和分支杆菌进行药敏试验，结果如下。

1.两种噬菌体对标准株的利福平药敏试验：利福平浓度为2μg/ml，利用Phage 40对H₃₇Rv、H₃₇Ra、大肠杆菌和耻垢分支杆菌mc155进行药敏试验，以4 h的发光值为标准，仅H₃₇Rv的发光值与阴性对照差异有显著性（P＜0.001），约为阴性对照的30倍，其他菌株的发光值均与阴性对照差异无显著性（P＞0.05）。同时又用Phage88对H₃₇Rv、H₃₇Ra、大肠杆菌和耻垢分支杆菌mc155进行药敏试验，以12 h的发光值为标准，仅H₃₇Rv的发光值与阴性对照差异有显著性（P＜0.001），约为阴性对照的60倍（P＜0.001），其他菌株的发光值均与阴性对照差异无显著性（P＞0.05）。

2.两种噬菌体对临床耐单药分离株的利福平药敏试验：利福平浓度为2μg/ml，用Phage 40对1株临床分离的结核分支杆菌耐药株和3株临床分离的非耐药结核分支杆菌株进行药敏试验，以4 h的发光值为判断标准，仅1株临床分离的结核分支杆菌耐药株的发光值与阴性对照差异有显著性（P＜0.001），约为阴性对照的20倍，3株临床分离的非耐药结核分支杆菌株的发光值均与阴性对照差异无显著性（P＞0.05）；同时又用Phage88对上述菌株进行了药敏试验，以12 h的发光值为判断标准，仅1株耐药结核分支杆菌株的发光值与阴性对照差异有显著性（P＜0.001），约为阴性对照的60倍，3株非耐药结核分支杆菌株的发