中华创伤杂志2000年第16卷第10期

孙晓庆付小兵盛志勇

关键词：表皮干细胞

皮肤是人体最大的器官,在抵御微生物入侵、紫外线辐射及防止水分的丢失、调节体温上起重要作用，同时也是免疫系统的组成部分之一。除了这些生物学功能外，皮肤在维持人的外貌上还起十分重要的作用。出生后各种原因所致的皮肤损伤即使愈合也会留下不同程度的损伤，目前尚缺乏有效的治疗手段。而实际上皮肤是再生能力较强的组织，皮肤外层的表皮终身不断自我更新，其基底部的干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞，从而进行组织结构的更新，外层细胞的死亡脱落与基底干细胞的分裂维持一定的平衡，这是维持正常的组织结构和细胞内环境稳定的基本要求^［1］。因此，了解表皮干细胞如何增殖与分化及其调控机制对于促进损伤皮肤功能与结构的完全修复意义重大。笔者就近年来对表皮干细胞的某些研究进展进行回顾。

一、表皮干细胞的概念、位置及数量

干细胞具有终身、无限的自我更新能力。它是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看年，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞（transit amplifying cells），短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞（committed progenitors）。短暂扩充细胞再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化，进一步可分化为有丝分裂后细胞（post-mitotic cells）及终末分化细胞（terminally-differentiated cells）。短暂扩充细胞的存在说明组织靠较少量的干细胞分裂为很多的子代分化细胞^［2］。干细胞自我更新和分化的方式通常有两种，一种是不对称方式分裂，即1个干细胞分裂成1个干细胞和一个定向祖细胞，常见于单细胞生物和无脊椎动物；另一种是具有高度调控机制的分裂方式，干细胞按一定的概率分裂成干细胞或定向祖细胞，即干细胞按一定的概率分裂为两个干细胞或两个定向祖细胞，或按不对称方式分裂,一般认为哺乳类动物即以此种方式进行自我组织更新。细胞的更新具有准确无误性，干细胞在整个增殖过程中处于相对静止状态，而由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充的任务，干细胞在分裂后仍保留其原有的遗传信息，短暂扩充细胞拥有新复制DNA序列，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞水平。通常干细胞等数分裂干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，干细胞的分裂方式会发生改变以适应机体的需要^［1，3］。

表皮干细胞最显著的两个特征是它的慢周期性（slow cycling）与自我更新能力。慢周期性在体内表现为标记滞留细胞（label-retaining cell），即在新生动物细胞分裂活跃时参入氚标的胸苷，由于干细胞分裂缓慢，因而可长期探测到放射活性，如小鼠表皮干细胞的标记滞留可长达2年。干细胞的自我更新能力表现为在离体培养时细胞呈克隆性生长，如连续传代培养，细胞可进行140次分裂，即能产生1×10⁴⁰个子代细胞^［1，4］。此外，表皮干细胞还有一个显著特点是对基底膜的黏附。干细胞主要通过表达整合素（integrins）实现对基底膜各种成分的黏附。整合素是一种由1个α亚基、1个β亚基组成的的双亚基蛋白，不同的α亚基与不同的β基组成了多种整合素，其中由β1亚基组成的整合素在表皮干细胞与基底膜的黏附中起重要作用。各种整合素作为受体分子与基底膜各种成分相应的配体结合，如与层黏连蛋白结合的有整合素α1β1、α2β1、α3β1及α6β4，与纤维黏连蛋白结合的有整合素α3β1，与胶原结合的有整合素α2β1。干细胞对基底膜的黏附是干细胞维持其特性的基本条件。干细胞对基底膜的脱黏附是诱导干细胞脱离干细胞群落，进入分化周期的重要调控机制之一^［5］。此外，目前体外分离、纯化表皮干细胞也是利用干细胞对细胞外基质的黏附性来进行的^［6］。

干细胞通常处于静息状态，分裂缓慢，在形态学上表现为细胞体积小，胞内细胞器稀少，细胞内RNA含量低，在组织结构中位置相对固定。虽然各种实验对表皮干细胞的位置和数量报道不一，但一般认为毛囊隆突部（皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘）含有丰富的干细胞。干细胞与短暂扩充细胞在表皮基底层呈片状分布，在没有毛发的部位如手掌、脚掌，表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层，其它有毛发的皮肤表皮干细胞则位于表皮脚处的基底层。表皮基底层中有1%～10%的基底细胞为干细胞，随着年龄的增大，表皮脚与真皮乳头逐渐平坦，表皮干细胞的数量也随之减少，这也是小儿的创伤愈合能力较成人强的重要原因之一^［1，7］。

二、干细胞分化的调控

干细胞的分化行为是被预先程序化还是受周围环境的调控一直是一个有争论的话题，但干细胞所处的微环境［又称为干细胞壁龛（niche）］对干细胞分化调控的影响是存在的^［8］。干细胞的分化受细胞与细胞（包括间质细胞如成纤维细胞、肥大细胞等）、细胞与细胞外基质间相互作用的影响。细胞因子在传递细胞与胞外基质之间、细胞与细胞之间的信息中起重要作用，这些细胞因子包括白细胞介素（Ils）、干细胞生长因子（CSF）、表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）等。细胞与细胞间相互调控信息还可通过细胞间黏着连接的β连环蛋白（β-catenin）来传递。此外，细胞外基质成分的改变也影响干细胞的分化，整合素在其中起重要作用。当干细胞微环境发生改变如损伤时，胞外某些信息可通过整合素α5β1、αvβ5及αvβ6传递给干细胞，以触发跨膜信号转导，调控细胞的基因表达。这一过程不仅可以改变干细胞的分裂方式，而且也激活干细胞的多潜能性，使干细胞产生一种或多种定向祖细胞，以适应组织修复的需要。因此，整合素α5β1、αvβ5及αvβ6也被称为创伤愈合过程中的应急受体（emergency receptor）^［4，8］。此外，表皮细胞在生长环境发生改变时可能会发生反分化。实验发现，将在体已不表达整合素而表达角蛋白K10的有丝分裂后细胞分离进行体外培养，这类细胞又可表现出显著的增殖能力，这与在创伤修复过程中已分化的基底层上部的表皮细胞可重新获得增殖能力相似^［5］。

表皮干细胞脱离干细胞群落进入分化阶段的一个重要表现是通过c-myc诱导并伴随表面整合素水平的下降，细胞对基底膜脱黏附，因而整合素水平的表达及干细胞的黏附特性可能是维持干细胞群落所必需的条件。整合素调控多种细胞的分化，其中表皮细胞与胞外基质黏附能力的缺失是终止干细胞进行自我更新而进行终末分化的强刺激因素。将β1整合素缺失的小鼠胚胎干细胞与表达野生型β1整合素的细胞相比，发现野生型干细胞能分化出完整的表皮细胞谱系，而β1整合素缺失的干细胞则不能产生分化的细胞。同样，当细胞外基质不存在时也诱导干细胞及短暂扩充细胞的分化，使表皮干细胞退出干细胞群落。此外还有实验发现细胞外基质具有修饰β1整合素表达与激活的作用。因而各种损伤因素引起的细胞外基质变化都可对干细胞的生物学行为产生作用。丝裂原激活蛋白酶(MAPK)在β1整合素调控表皮干细胞增殖分化的信号转导通路中起重要作用。将结构域阴性的β1整合素的突变体转染到培养的人表皮形成细胞，以干扰其β1整合素的功能，降低β1整合素的黏附性，结果发现转染成功的表皮干细胞表面β1整合素水平及细胞与IV型胶原的黏附性明显降低，MAPK活性减弱，细胞的克隆形成能力下降，增殖潜能丧失，表现出短暂扩充细胞的特征。但通过超表达野生型β1整合素或激活MAPK则可上调整合素的表达，恢复其黏附性及增殖潜能^［9］。

三、干细胞的鉴别

利用干细胞最显著的两个特征即慢周期性及自我更新能力来鉴定在体与离体干细胞是最基本且可靠的实验手段。由于干细胞的慢周期性，可采用标记滞留细胞的分析方法识别在体的静息干细胞。干细胞的自我更新能力在体外培养则表现为无限的增殖能力，形成细胞克隆，从而识别离体的干细胞。但这两种方法应用不方便，目前利用表皮干细胞一些相对特异的标志建立了一系列的表皮干细胞鉴别方法^［1］。

由于表皮干细胞及短暂扩充细胞表面高表达β1整合素，而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达β1整合素，因而可以用β1整合素的抗体来鉴别表皮干细胞及短暂扩充细胞。虽然表皮干细胞β1整合素的表达量约为短暂扩充细胞的两倍，但一般的光镜下尚不能依靠β1整合素阳性强度的不同来区分干细胞和短暂扩充细胞。如果利用激光共聚焦显微镜，将组织切片进行1μm的断层扫描，即在单层细胞水平上观察，则可以分辩出干细胞与短暂扩充细胞表达β1整合素阳性强度的差异^［5，10］。

近来，有实验结合干细胞表面的α6整合素及另一个与增殖有关的表面标志10G7，可以区分干细胞与短暂分化细胞。检测发现α6阳性而10G7阴性（α6^bri10G7^dim）的细胞处于静息状态，在体外培养中具有很强的增殖潜能，证实为干细胞：而α6与10G7均阳性（α6^bri10G7^bri）的细胞是短暂扩充细胞，体外培养证实其增殖能力有限；α6阴性的细胞其角蛋白K10则呈阳性表达，说明是有丝分裂后终末分化细胞。因而可以利用α6整合素与10G7的单抗来区分干细胞、短暂扩充细胞和分化的表皮细胞^［10］。

角蛋白（Keratins）是表皮细胞的结构蛋白，它们构成直径为10 nm的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构。随着分化程度的不同，