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刘阳孙宪丽李彬王津津
摘要目的观察锗132对体外培养翼状胬肉成纤维细胞的抗增殖作用，寻找辅助治疗翼状胬肉和预防翼状胬肉复发的新方法。方法将翼状胬肉成纤维细胞行体外原代和传代培养；观察不同浓度锗132及丝裂霉素C对成纤维细胞生长曲线的影响及对培养的翼状胬肉成纤维细胞增殖抑制作用和毒性作用；采用免疫组织化学方法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）的表达。结果锗132可抑制体外培养的翼状胬肉成纤维细胞对PCNA的表达，使其生长曲线显著下移；对翼状胬肉成纤维细胞的增殖抑制作用呈剂量依赖性，且无细胞毒性反应。结论锗132可有效抑制翼状胬肉成纤维细胞的增殖活性。
关键词：锗132；翼状胬肉；成纤维细胞；组织培养
治疗翼状胬肉的手术方法较多，但均不能有效地降低其复发率。目前常采用的一些辅助疗法，如用氩激光、准分子激光、β放射线及免疫抑制剂（5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C）等方法试图降低翼状胬肉术后的复发率，未见明显疗效，但有增加并发症的可能，因此寻找有效、副作用少的治疗方法是许多学者所面临的研究课题。
近年来，许多研究结果证实［1，2］，锗132（carboxyethyl germanium sesquioxide,羧乙基锗倍半氧化物）是一种具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节及抗病毒等广泛药理作用的化合物。浅井一彦首先发现人参、枸杞及猢狲眼等中药中均富含锗132；1976年Tsutsui等［1］证实，锗132的化学结构为，同年首次人工合成锗132，并在一些动物移植性瘤株中证实其具有较强的抑瘤效应。但是，对锗132的抗肿瘤、抗增殖作用的研究，目前仅限于全身给药途径的实验研究和临床观察，对眼局部抗增殖作用的研究尚未见报道。为此笔者应用不同浓度锗132对体外培养的翼状胬肉成纤维细胞抗增殖作用进行观察，寻找治疗翼状胬肉的新方法，同时探讨其作用机制。
材料与方法
一、翼状胬肉成纤维细胞体外培养及鉴定
1.原代培养：翼状胬肉组织标本由首都医科大学附属同仁医院眼科门诊手术室提供。细胞培养参照Chen等［3］的方法。DMEM培养液（美国Sigma公司），内含20%小牛血清（北京红星生物制品公司）及10 mg/L庆大霉素。原代接种3 d后观察组织块贴壁情况、培养液色泽以及是否有微生物污染。然后均于每3或4 d更换1次培养液，并每天在相差显微镜下观察细胞生长状况及形态特征。
2.传代培养：待成纤维细胞生长至80%汇合时，以0.25%的胰蛋白酶（美国Difco公司）作用细胞约5min，再加入适量培养液并用吸管吹打瓶壁使细胞悬起、分散，以血球计数板（上海市沪江医疗器材经营部）计数细胞，并按1∶2或1∶3分种细胞，每3或4 d更换1次培养液。
3.翼状胬肉成纤维细胞鉴定：以兔抗人波形蛋白单克隆抗体、细胞角蛋白单克隆抗体(北京中山生物技术有限公司）经过氧化物酶标记链霉卵白素（SP）法行免疫组织化学染色，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，并结合细胞生长特性及形态学特征，确认所培养的细胞为成纤维细胞。
二、锗132对培养的翼状胬肉成纤维细胞抗增殖作用观察
1.观察锗132作用后细胞形态学变化：在传代至第3或4代的翼状胬肉成纤维细胞（贴壁24 h后）中加入锗132（广州军区药检所提供），并以丝裂霉素C（mitomycin-C，MMC）为对照，使其终浓度分别为2500 mg/L及25 mg/L，培养24、48及72 h后在相差显微镜下观察细胞分布及形态学变化。
2.增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的检测：将细胞悬液接种于铺有盖玻片（按细胞培养用品清洗和高压灭菌）的6孔板中，孵育24 h后分为A、B两组，A组为对照组，B组为锗132组（终浓度为2 500 mg/L），孵育24 h后取出盖玻片，经免疫组织化学SP法染色（同前）检测PCNA（鼠抗人PCNA单抗，Santa cruz公司）的表达。结果分析采用比较PCNA标记指数（labelling index, LI），即平均每100个细胞中的阳性细胞数。计数6个视野（放大倍率20×10）的全部阳性细胞及阴性细胞并列表，将计数资料进行χ2检验。
3.对成纤维细胞的增殖抑制作用检测：四甲基偶氮唑盐法（tetrazolium bromide，MTT)。向平底96孔板内加入5×104/ml的细胞悬液100μl/孔；待细胞贴壁24 h后，分别加入不同浓度的锗132（39、78、156、313、625、1 250、2500及5 000 mg/L）、MMC（3.13、6.25、12.5、25 、50、100、200及400 mg/L），每种药物按不同浓度分别设3个平行孔（并设无药物空白对照孔）；然后置37℃、体积分数为5%的CO2条件下培养48 h；每孔加入浓度为5 000 mg/L 的四甲基偶氮唑盐溶液20 μl，置培养箱内过夜；每孔加入20%十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulphate，SDS)-50%二甲基甲酰胺（N,N-dimethyl formamide，DMF）100μl，室温下静置6 h；于酶联免疫检测仪（美国Bio RAD450）上测定各孔吸光度(A)值（最大吸收波长为600 nm）。将此实验重复2次。计算药物对细胞的抑制率%=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%，并绘制抑制率曲线［4］。
4.成纤维细胞生长曲线的绘制：调整细胞浓度为4×104/ml，取可拆卸96孔板，将每条板的各个孔（共16个孔）内接种100μl上述细胞悬液，并将每板平均分为A、B两组（每组8孔），A组为对照组，B组为锗132组（终浓度为1000 mg/L），每日取出其中1条，按实验方法3进行MTT实验，绘制细胞生长曲线。
结果
一、培养细胞生物学特性
1.培养细胞的镜下形态：翼状胬肉组织块接种24 h后即可见细胞由组织块中游离出，并逐渐形成生长晕，在1或2周时为排列紧密的单层圆形或多边形类上皮细胞，核分裂像多见，胞核较小、圆形，位于细胞中央。相邻细胞间连接紧密，相互衔接成片（图1）。仅见少量散在的成纤维细胞由组织块向四周呈放射状游离出，且这些细胞多贴附于上皮细胞表面。成纤维细胞为长梭形、三角形、扇形或不规则形态，体积大、小不一，胞核呈椭圆形，位于细胞中央（图2）。培养至2周后，成纤维细胞逐渐增多，与上皮细胞分界清晰，呈瀑布状、放射状及螺旋状或编织状排列，至汇合时，细胞排列密集，细胞界限不清，部分胞体交叉重叠，并随着时间的延长，其增殖活性增强；而上皮细胞轮廓清晰，胞浆内颗粒增多，趋于老化、脱落，消失。
图1原代培养翼状胬肉上皮细胞，细胞紧密连接，相互衔接成片相差显微镜×40
图2原代培养翼状胬肉成纤维细胞，示细胞形态及排列方式相差显微镜×40
2.两种原代贴壁细胞对胰蛋白酶的耐受性：在0.25%胰蛋白酶作用下，5 min后即可见成纤维细胞收缩、变圆、易于被吹打下来；而上皮细胞则在短时间内很难被胰蛋白酶消化，个别被消化和吹打下来的细胞，大多不收缩变圆而呈片状；在再次贴壁过程中，成纤维细胞可在20 min内全部贴壁，随后逐渐附壁、延展及极性化，而上皮细胞则极少再贴壁。
二、成纤维细胞免疫组织化学鉴定
体外培养的翼状胬肉成纤维细胞经SP法染色可见波形蛋白表达阳性（图3），阳性表达位于胞浆，呈现与成纤维细胞长轴方向一致棕黄色束状或网状结构；细胞角蛋白表达阴性（图4）。
图3翼状胬肉成纤维细胞波形蛋白表达阳性免疫组化染色SP×200
图4翼状胬肉成纤维细胞角蛋白表达阴性免疫组化染色SP×100
三、锗132对翼状胬肉成纤维细胞的影响
1.锗132组：药物作用24 h后无显著变化；48 h后大部分细胞收缩、但未变圆及脱壁；72 h后，几乎全部细胞变圆，部分脱壁，无细胞碎裂、崩解，细胞数无明显减少（图5）。
图5锗132作用翼状胬肉成纤维细胞72 h后，示细胞变圆、脱壁，无细胞碎裂、崩解相差显微镜×40
2.MMC组：早期细胞形态正常，随时间的延长细胞可出现毒性反应，可见细胞碎裂、崩解，细胞数逐渐减少至无活性细胞，仅见少量贴壁无活性细胞（图6）。
