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刘祖国谢玉环张梅Stephen c. Pflugfelder
摘要目的了解表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)家族的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白在翼状胬肉上皮内的表达。方法用免疫荧光组织化学及Western blot方法对15例初发期翼状胬肉患者切除的翼状胬肉组织进行EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白的检测，并与正常人结膜组织进行对照。结果免疫荧光组织化学染色显示，在正常结膜上皮中，EGFR蛋白可表达于基底层细胞表面，而ErbB2及ErbB3蛋白则表达于表层细胞。15例翼状胬肉患者中，11例翼状胬肉上皮的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白均表达于翼状胬肉上皮的全层，4例表达方式与正常结膜相似。Western blot检测显示，11例翼状胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白带较正常结膜密度高。结论翼状胬肉组织上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白表达增加，提示翼状胬肉可能是一组织增生性疾病，翼状胬肉上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白的异常表达及其与上皮下组织相互作用可能是翼状胬肉发病的重要原因之一。
关键词：翼状胬肉；结膜；表皮生长因子；发病机制
翼状胬肉是眼科较为常见的眼表面疾病之一，在赤道及阳光辐射高的地区其患病率较高［1,2］。翼状胬肉组织向角膜中央生长可引起角膜散光而导致视力下降，如进入瞳孔区则严重影响视力。手术切除是治疗此病的惟一方法，但其术后复发率较高［3］，可严重影响视力。目前的研究证明，紫外线是翼状胬肉致病的最重要原因［1,2,4-6］，但其发病机制仍不十分清楚。
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、ErbB2、ErbB3及ErbB4蛋白为Ⅰ型生长因子受体家族的4个成员［7,8］，它们具有共同的分子结构。以往的研究表明，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白与细胞的增殖、移行及分化有密切的关系，并在其调节过程中发挥着重要作用。宋建新和刘秋润［9］发现EGFR、ErbB2及ErbB3在部分肿瘤组织中的阳性表达较高，因此目前认为其可能与某些肿瘤的发生、发展有关。
翼状胬肉临床表现为新生的组织不断生长，并向角膜浸润，手术切除后易复发，这些特点与肿瘤组织相似。为了解翼状胬肉上皮细胞的生物学特性，我们用免疫荧光组织化学及Western blot方法，对15例初发期翼状胬肉患者的翼状胬肉上皮中的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白表达情况进行研究，并与正常结膜组织进行比较，旨在为提供其发病机制的依据，现将结果报告如下。
材料与方法
一、标本来源
共收集本院门诊15例初发期翼状胬肉患者的手术标本，其中男性9例，女性6例；年龄29～58岁。正常结膜12例，取自猝死尸体，均在死后12 h内获取。
二、实验材料
EGFR、ErbB2及ErbB3单克隆抗体购自美国NeoMarker公司，荧光标记抗体购自美国Caltag laboratories公司。
三、实验方法
取15例翼状胬肉及12例正常结膜标本，每例标本1/2行免疫荧光组织化学染色，1/2行Western blot方法进行检测，分别观察上述组织中EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白的表达。
1．免疫荧光组织化学染色：将新鲜结膜组织及翼状胬肉组织分别用冰冻组织包埋剂OCT（美国Miles公司）包埋，冰冻组织超微切片，置-80℃冰箱备用。超微组织切片用10%甲醛液固定10 min，玻片置于PBS加2%小牛血清液中20 min，以去除非特异性染色，然后加第1抗体于玻片置室温1 h，PBS漂洗3次，每次5 min。再加荧光标记的第2抗体于玻片上，置室温1 h，同上漂洗，常规封片。于日本Topcon荧光显微镜下观察结果，用Nikon相机及Kodak胶卷摄影。
2．Western blot标本处理：用分离法分别提取正常结膜及翼状胬肉上皮，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150 mmol/L NaCl、1NP-40、0.5去氧胆酸及50 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)中，室温下1 h，离心10 min(13 000 r/min)，取上清液，检测蛋白浓度。
3．Western blot检测：将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3 min，分别加入4%～15%十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶，电泳45～60 min(电压200 V)。将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜，在90 v电压下转移1 h，将其置于3%无脂牛奶中1 h(去除非特异性染色)后取出，加第1抗体(抗体稀释液：1%小牛血清、Tris盐溶液、0.5 tween 20)于硝酸纤维膜，室温下1 h，漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体，再置室温1 h，漂洗3次，用放射自显影法显影，Kodak X胶片摄影。Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较。
结果
一、免疫荧光组织化学染色
EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白呈细胞膜型染色，细胞核及细胞浆染色阴性。在正常结膜上皮标本中，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白均呈阳性染色，但染色部位不同；EGFR蛋白表达于正常结膜上皮的基底层细胞，表层细胞染色极弱或阴性；ErbB2及ErbB3蛋白则表达于结膜上皮的表层细胞，基底层细胞染色极弱或阴性。15例翼状胬肉标本中，4例EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白染色方式与正常结膜相似；11例与正常结膜明显不同，与正常结膜相比，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白均表达于翼状胬肉上皮的全层(图1～6)，且染色较正常结膜上皮强。
二、Western blot检测结果
取相同蛋白浓度检测发现，在15例标本中，免疫荧光染色上皮呈全层染色的11例翼状胬肉其上皮EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白表达带较正常结膜密度明显增高(图7)。4例免疫荧光组织化学表达方式与正常相似，其EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白带的密度与正常基本相似。由此可见，正常结膜及翼状胬肉上皮组织均存在EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白，进一步证实了免疫荧光组织化学染色的结果。
讨论
目前翼状胬肉已成为眼表面最为重要的疾病之一。由于其患病率高及术后复发率高等特点，翼状胬肉的研究一直受到许多学者的关注。流行病学调查发现，紫外线辐射是使其发病较为重要的因素［1,2,4-6］，但其发病机制至今尚未阐明。以往认为翼状胬肉是结膜组织变性性疾病，但在临床的观察中并不完全支持这一结论，笔者通过观察表皮生长因子受体家族在翼状胬肉上皮的表达，旨在为提供其发病机制的依据。
一、表皮生长因子受体的功能及表达
表皮生长因子受体家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3及ErbB4 4个成员，它们具有共同的分子结构。以往的研究发现，EGFR、ErbB2及ErbB3与细胞的增殖、移行及分化有密切的关系，并在其调节过程中发挥着十分重要的作用［10,11］。在肿瘤的研究中，EGFR、ErbB2及ErbB3呈现高表达，且其表达量与某些肿瘤的预后有明确的关系，被认为可能与某些肿瘤的发生和发展有关［9,12］。表皮生长因子受体家族是一类与细胞分裂、移行及增殖明显相关的受体，当该受体家族在某些细胞表达增加时，说明这些细胞处于增殖的活跃期。在细胞培养及动物实验中发现，EGFR在角膜伤口愈合中表达明显增加［13］，说明表皮因子受体家族与眼表面上皮细胞的生长有关。笔者在检测角膜、角膜缘及结膜上皮中表皮生长因子受体家族的表达中发现，EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白在正常角膜、角膜缘及结膜上皮中，均有表达；在眼表面上皮的表达中，EGFR主要表达于具有分裂能力的细胞，而ErbB2及ErbB3则主要表达于终末细胞。
二、翼状胬肉可能是一种组织增生性疾病
本文的研究结果显示，在15例初发期翼状胬肉上皮中，11例翼状胬肉上皮中的EGFR、ErbB2及ErbB3蛋白阳性表达带较正常结膜的密度高，提示翼状胬肉上皮细胞呈现高增殖状态。细胞的高增殖状态是组织增生性疾病的生物学标志。最近的研究发现，p53基因在翼状胬肉表达增加［5,6］，在我们的研究中也发现了突变型p53基因的表达与此疾病的家族史及紫外线辐射有明确的关系。此外临床上翼状胬肉表现为新生组织不停的增生，并向角膜浸润，符合组织增生性疾病的临床表现。因此，我们认为翼状胬肉是组织增生性疾病而不是组织变性性疾病，细胞因子及其受体的异常表达可能与该病的发生及发展有关。三、翼状胬肉的发病机制探讨
目前对翼状胬肉上皮表皮生长因子受体家族表达增加的研究结果，尚不能明确显示其是否为翼状胬肉发病的原因还是结果，这尚需进一步的研究。但是，翼状胬肉上皮细胞因子及其受体与其基质的细胞因子的相互作用是影响翼状胬肉发生、进展及复发的重要因素之一［14-16］。
图1 正常结膜上皮EGFR主要表达基底层细胞免疫荧光染色×200
图2 正常结膜上皮ErbB2蛋白主要表达于表层细胞免疫荧光染色×200
