中华皮肤科杂志2000年第33卷第4期

陕声国张端莲侯祚琼王志龙道畴

关键词：瘢痕；成纤维细胞；凋亡

瘢痕疙瘩是以持续增生，渐向周围皮肤侵蚀，切除后易复发为特征的皮肤纤维化疾病。我们用免疫组化和原位缺口末端标记（TdT－mediated dUTP Nick end labeling,TUNEL）法对24例患者皮损及其周围皮肤细胞增殖和凋亡状态进行了研究。

一、材料与方法

1.标本的来源和处理：24例瘢痕疙瘩患者，男15例，女9例，年龄4～68岁，均取自湖北医科大学附属第一医院整形外科1998年手术切除标本。所有实验对象均符合以下标准：①病程超过1年；②病变超过伤口范围；③具有持续增长、发红、发痒的临床症状；④未经过激光、冷冻、皮质类固醇等治疗。切取有临床症状的部位为实验组，周围正常皮肤为对照组。所有的标本均经过HE染色病理确诊。标本离体后0.5h内用10％中性福尔马林液固定16～24h，脱水，包埋。每例标本连续切片3张。1张作HE染色，1张作免疫组织化学染色，1张作细胞凋亡检测。

2.试剂来源：实验用鼠抗人增殖细胞核抗原（PCNA）单克隆抗体及免疫组化试剂盒购自福建迈新生物技术公司。凋亡试剂盒购自美国Roche公司。

3.免疫组化实验步骤：采用链霉亲和素－过氧化酶连接法（SP法）检测PCNA。主要实验步骤：5μm切片脱蜡入水；置于250W微波抗原修复10min；参照说明书进行SP染色，其中抗PCNA单克隆抗体孵育时间为37℃，2h。阴性对照组以PBS代替一抗。同一张表皮作阳性对照。

4.TUNEL法检测细胞凋亡：参照Roche公司实际说明书进行实验。主要步骤为：5μm切片脱蜡入水；置于250W微波抗原修复8min；加3％H2O2，37℃10min，双蒸水洗；加小牛血清，37℃15min；甩干后加TdT（末端脱氧核苷酸转移酶）和荧光素标记的dUTP，37℃孵育1 h，PBS洗；加结合有过氧化物酶的抗荧光抗体， 37℃孵育0.5h；DAB显色。阴性对照用PBS代替荧光素标记的dUTP，阳性对照组为同一切片的表皮。

5.统计学处理：凋亡指数（apoptoticindex,AI）、增殖指数(proliferativeindex,PI)为显微镜下计数10个高倍镜视野，至少计数2000个成纤维细胞，计算凋亡细胞、增殖细胞占细胞总数的百分比。AI与PI比值为同一标本切片中凋亡指数与增殖指数百分比。利用配对t检验进行统计学处理。

二、结果

1.增殖细胞检测结果：PCNA阳性染色显棕黄色细颗粒状，主要位于细胞核。24份平均增殖指数为61.23，周围正常皮肤平均增殖指数为1.44。二者经配对t检验，t=23.67，P＜0.01。

2.TUNEL法检测结果：凋亡细胞核含棕黄色细颗粒。24份平均凋亡指数为0.99，周围正常皮肤平均凋亡指数为0.098。二者经配对t检验，t=3.60，P＜0.01,差异具有非常显著性。

3.AI/PI比值分析结果：24份AI/PI比值平均为0.0159，周围正常皮肤为0.0706。二者经配对t检验，t=0.07，P＜0.01。表明增殖的增加明显高于凋亡的增加，凋亡细胞相对减少。

三、讨论

细胞凋亡时，DNA链在内切核酸酶的作用下发生断裂，产生3′－OH末端，该末端在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）作用下，可以转移上一个标记的dUTP。该方法可以定性定量地反映细胞凋亡状态^[1]。瘢痕疙瘩组织较正常皮肤PI升高，表明瘢痕疙瘩增殖活跃。尽管AI较正常皮肤升高，但AI/PI比值较正常皮肤降低，表明瘢痕疙瘩组织凋亡相对减少。以上实验结果说明细胞增殖的增加和细胞凋亡的抑制共同参与了瘢痕疙瘩的形成和发展过程。许多研究证实瘢痕疙瘩内微血管由于内皮细胞的增生凸出而阻塞，组织内氧分压降低，二氧化碳分压升高。瘢痕疙瘩内成纤维细胞能在营养和养分缺乏的情况下异常增殖，凋亡减少，表明瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞是瘢痕体质的个体在伤口愈合过程中特殊成纤维细胞群体选择性增殖形成的^[2]。

作者单位：陕声国（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院整形外科)

张端莲（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院整形外科)

侯祚琼（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院整形外科)

王志（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院整形外科)

龙道畴（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院整形外科）

参考文献

［1］Garrieli Y, Sherman Y, Bensasson sA. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol, 1992,119:493－ 501.

［2］Kischer CW, Thies AC,Chrapil M. Perivascular myofibroblasts and microvascular occlusion in hypertrophic scars and keloids. Hum Pathol,1982,13:819－ 924.