中国医学科学院学报2000年第22卷第4期

张洪美吴宁华沈珝琲

摘要目的研究维生素D₃(VD₃)、9-顺式维甲酸(9-cis-RA)及其相应核受体对hsp90β基因表达的调控作用。方法采用DEAE-Dextran方法将人hsp90β基因调控片段(-1039 bp/+1 531 bp)介导的荧光素酶(Luc)报告基因质粒β1.11转染Jurkat细胞，并用VD₃和9-cis-RA分别或同时刺激细胞，或将质粒β1.11及野生型维生素D₃受体(VDR)或/和维甲酸X受体α(RXRα)真核表达质粒共转染Jurkat细胞，检测细胞裂解液中荧光素酶活性；用Western印迹分析方法检测经VDR真核表达质粒转染或用 vD₃和9-cis-RA刺激的Jurkat细胞中内源性Hsp90β蛋白的改变；通过电泳迁移率变更分析(EMSA)实验，检测VDR和RXR能否与含有hsp90β基因第一内含子中维生素D₃应答元件(iVDRE)的双链寡核苷酸片段发生特异结合。结果VD₃和9-cis-RA可分别低水平诱导hsp90β基因表达，而两种配体同时加入有协同作用。VDR或RXRα分别转染只能较弱地抑制hsp90β基因表达，二者共转染能增强其抑制作用。EMSA实验证实，VDR和RXR都可特异结合于iVDRE上。结论VD₃和9-cis-RA这两条信号途径共同参与hsp90β基因的启动子活性调节。

关键词：维生素D₃；9-顺式维甲酸；维生素D₃受体；维甲酸X受体；热休克蛋白90β；表达调控

热休克蛋白(Hsp)是核受体、信号传导激酶或转录因子的特异分子伴侣。一些核受体如糖皮质激素受体等，通过C-端配体结合结构域与Hsp90等多种分子伴侣复合物结合，可保持稳定状态，并且是与配体结合的先决条件^［1］。但迄今尚鲜有报道证实这些功能蛋白质是否调控hsp90β基因的表达。

核受体家族是一个庞大的配体依赖性的转录因子家族，核受体的配体作用非常广泛，几乎包含了生物体发育、维持自身稳态、细胞分裂、分化等所有基本生命过程^［2］。与其他真核转录因子一样，核受体作用也依赖与其结合的特定DNA序列，但一般以同源或异源二聚体形式发挥作用。作为核受体家族的一员，当维生素D₃受体(VDR)与维生素D₃(VD₃)结合发挥功能作用时，VDR首先与VD₃应答元件(VDRE)结合。典型的VDRE是由2个6 bp的保守序列(GGGTGA)相隔3个核苷酸形成的同向重复序列。研究表明，在许多基因中VDR通过与维甲酸X受体(RXR)形成异源二聚体共同结合于VDRE^［3］。本组在研究hsp90β基因的转录调控机制时发现，第一内含子在hsp90β基因组成性及热诱导表达中起重要作用，而其中含有与骨钙素(osteocalcin)基因调控序列中相同的VDRE样序列GGGTGA(N)₁₀GGGTGA(+233 bp/+254 bp)^［4］。本研究主要探讨该序列是否参与hsp90β基因的表达调控及调控机制。

材料和方法

材料荧光素酶(Luc)活性检测试剂盒为Promega公司产品；BCA蛋白检测试剂盒为Pierce公司产品；硝酸纤维素膜为Schleicher& Schuell公司产品；含有hsp90β基因第一内含子中VDRE的DNA寡核苷酸片段由上海生工生物工程技术公司合成；［α-³²P］-dATP(1×10¹⁴ bq/mmol)及［α-³²P］-dCTP(1×10¹⁴ Bq/mmol)购自北京亚辉生物医学工程公司；第一抗体抗VDR多克隆抗体、抗RXR多克隆抗体和抗Hsp90β抗体为Santa Cruz公司产品；第二抗体辣根过氧化物酶标记的抗山羊IgG抗体和抗兔IgG抗体购自中山生物技术公司；增强型化学发光系统(ECL)为Amersham公司产品。

质粒和细胞株含有编码VDR全长cDNA的真核表达质粒pAhVDR由美国Baylor医学院Ming-Jer tsai教授惠赠；含有编码RXRα全长cDNA的真核表达质粒mRXRα由法国Louis pasteur大学Pierre Chambon教授惠赠；含有hsp90β基因调控序列(-1 039 bp/+1 531 bp)的荧光素酶报告基因质粒phsp90β1.11由本组提供；Jurkat细胞为本组保存的细胞株。

质粒转染基本按照文献［5］方法进行。以DEAE-Dextron方法转染Jurkat细胞，在研究VD₃和9-cis-RA对hsp90β基因表达的影响时，在Jurkat细胞中各转染5μg质粒phsp90β1.11，37℃培养24 h后，分别加入无水乙醇或不同浓度的VD₃或/和9-cis-RA继续培养24 h后收集细胞，测定Luc活性。在检测VDR及RXRα对hsp90β基因表达的调控作用时，第1组为对照组，转染5μg β1.11；第2组共转染5 μg β1.11与1 μg pAhVDR；第3组共转染5 μgβ1.11与1 μg mRXRα；第4组共转染5 μg β1.11与1 μg pAhVDR、1 μg mRXRα。

荧光素酶活性的测定收集转染细胞，用PBS溶液洗2次，加200μl细胞裂解液悬浮细胞，室温下反应1 h，12 000 r/min离心3 min，取20μl上清，用荧光检测试剂在Monolight 2010荧光发光检测仪上测定发光强度。用BCA蛋白检测试剂盒测得的蛋白质浓度校正相应裂解液的发光强度值。

全细胞抽提物(WCE)制备基本按文献［6］方法进行，将Jurkart细胞用冷的PBS洗涤2次后，以300μl修饰的放射免疫沉淀分析溶液裂解，将裂解液离心15 min(12000 r/min)后收集上清，以BCA蛋白分析试剂盒测定上清中的总蛋白浓度。

Western免疫印迹-ECL分析50 μg WCE经10%SDS-PAGE分离后转移到硝酸纤维素膜上，然后用含有5%脱脂奶粉的TBST在室温下将硝酸纤维素膜封闭60 min后，以TBST洗涤1次，继之与1∶1 000稀释的第一抗体(抗VDR多克隆抗体、抗RXR多克隆抗体和抗Hsp90β抗体)室温孵育60 min，再以TBST洗涤3次，每次10 min，然后再与1∶2 000稀释的相应的第二抗体室温孵育60 min，经TBST洗涤3次，每次5 min，最后用ECL检测Hsp90β、VDR等蛋白的表达水平。

细胞核抽提物的制备室温下收集2×10⁷个Jurkat细胞，用4℃预冷的PBS溶液洗2次，加入500μl预冷的Buffer A(50 mmol/L KCl、25 mmol/L

hEPES,pH7.8、0.5% Nonidet P-40(NP-40)、1 mmol/L PMSF、0.1 mmol/L DTT)悬浮细胞，冰浴放置4 min，4℃ 12 000 r/min离心1 min，弃上清，然后先用500 μl预冷的Buffer b(不加NP-40，其余同Buffer A)洗沉淀，4℃ 12 000 r/min离心1 min，弃上清，再用300μl预冷的Buffer C(500 mmol/L KCl、25 mmol/L HEPES，pH7.8、10%甘油、1 mmol/L PMSF、0.1 mmol/L DTT)溶解沉淀，冰浴放置10 min，4℃ 12 000 r/min离心1 min，分装上清，保存于-80℃。

探针的标记取等摩尔数的含有hsp90β基因第一内含子中VDRE(+233 bp/+254 bp)互补序列的两段寡核苷酸片段5′-TATAGGGTGAGGGTAG-TGGTGGGTG-3′及5′-AACCTCACCCACCACTA-CCCT-3′，于90℃加热5 min后退火过夜，取10 ng退火后的片段，按文献［7］中方法进行末端补平标记。

电泳迁移率变更分析法(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)基本按照文献［4］方法进行。为检测与探针结合的蛋白质复合体中是否含有VDR、RXR，分别在2个反应体系中加入1μl VDR抗体或RXR抗体，4℃反应30 min，反应结束后用5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。凝胶经80℃真空干燥后，于-70℃进行放射自显影。

结果

VD₃和9-cis-RA对Jurkat细胞中hsp90β基因转录的影响将转染有phsp90β1.11质粒的Jurkat细胞用不同浓度的VD₃和9-cis-RA刺激时，随着VD₃和9-cis-RA浓度升高，细胞裂解液中Luc活性逐渐增高；当两种配体同时使用时，Luc活性则明显增高(图1、图2)。

图 1VD₃对hsp90β基因的诱导作用

fig 1 Induction effect of VD₃ on hsp90β

图 2VD₃和9-cis-RA对hsp90β基因的诱导作用

fig 2 Induction effect of VD₃ and 9-cis-RA on hsp90β

VD₃和9-cis-RA对Jurkat细胞中hsp90β基因的蛋白表达的影响以不同浓度的VD₃和9-cis-RA刺激细胞，用Western印迹分析方法检测内源性Hsp90β蛋白。结果显示，单独用VD₃或9-cis-RA刺激细胞时，Hsp90β蛋白无肉眼可见的明显改变(结果未附)；而用两种配体同时刺激细胞时，随着9-cis-RA浓度的升高，Hsp90β逐渐增多(图3)。

图 3不同浓度VD₃和9-cis-RA对Hsp90β蛋白表达的影响

fig 3 Effect of VD₃ and 9-cis-RA in different concentrations on hsp90βVDR及RXRα对hsp90β基因表达的调控作用将含有hsp90β上游序列至第一内含子(-1039 bp/+1 531 bp)的荧光素酶报告基因质粒β1.11，分别与编码VDR或/和RXRα的cDNA表达质粒共转染Jurkat细胞。结果显示，与仅转染β1.11的对照组相比，分别共转染VDR或RXRα表<