中华病理学杂志2000年第29卷第3期

靳玉兰张伟刘伯齐王洪平韩志楷金玉生 刘义曲平丁镇伟王立峰李茉林培中

关键词：食管癌；Ki67；p53一、材料与方法

1.样品：336份活检标本均为河北磁县1996年食管癌普查中病人的活检组织。病理学诊断：原位癌80份，重度不典型增生51份，中度106份，轻度74份，正常食管鳞状上皮25份。组织学诊断由我院病理科做出。

2.试剂：抗p53蛋白单克隆抗体（鼠），抗Ki67多克隆抗体（兔）均为DAKO公司产品，ABC-SAP试剂盒购自北京中山实业公司。

3.方法：碱性磷酸酶标记的ABC法。即：石蜡切片常规脱蜡，置柠檬酸溶液中（pH为6.0），微波炉修复5 min，PBS漂洗后，正常山羊血清封闭10 min，加一抗4℃过夜，二抗37℃30 min，碱性磷酸酶标记的链霉卵白素复合物37℃ 30 min，显色底物BCIP/NBT37℃ 5 min，用水冲洗终止显色，1％伊红复染，梯度乙醇脱水，封片观察。

4.结果判断及统计分析：粉红色背景下有核蓝染即为阳性（图1,2），否则为阴性。＋：核阳性细胞不超出上皮层的下1/3,＋＋：核着色细胞在上皮层下1/3和下2/3之间,＋＋＋：核着色细胞蔓延到上皮层上1/3范围。设阴、阳性对照。结果分析用计数资料的结构相对数、χ²检验及等级相关分析^［1］。

二、结果

1.各组病变食管上皮Ki67免疫组织化学染色结果：等级相关分析指出Ki67表达程度与组织学分级呈正相关(r=0.5837，P＜0.001)。经χ²检验，正常组与不典型增生总体及癌组的Ki67蛋白的表达阳性率差异均有显著性意义(P＜0.001)，轻度与中度不典型增生组织差异无显著性意义(P＞0.05)。≥++阳性表达率除在重度不典型增生与原位癌间差异无显著性意义外(P＞0.05)，其他组织间差异均有显著性意义（P＜0.05)。

2.不同病变食管上皮p53蛋白免疫组织化学染色结果：经等级相关分析，p53蛋白异常表达与组织学分级呈正相关(r=0.3597，P＜0.001)。经χ²检验，正常组与不典型增生组及原位癌组织的p53表达差异有显著性意义(P＜0.001)。中、重度不典型增生与原位癌组织的表达差异无显著性意义(P＞0.05)。≥++阳性表达率除在重度不典型增生与原位癌组织间差异无显著性意义外(P＞0.25)，其他组织间差异均有显著性意义（P＜0.05)。

3.p53蛋白与细胞增殖指标Ki67二者在所有病变组织及正常粘膜组织中的表达呈正相关：经等级相关分析，Ki67和p53蛋白在各种病变组织中的的表达呈正相关(r=

图1中度不典型增生上皮组织中Ki67中度（++）阳性表达，阳性信号定位于细胞核ABC法×100

图2中度不典型增生上皮组织中p53中度（++）阳性表达，阳性信号定位于细胞核ABC法×100

4.综合分析Ki67、p53蛋白在各组病变组织中的异常表达情况，经等级相关分析得(Ki67, p53)表达与组织学分级有正相关(r=0.589 7, P＜0.001)。

三、讨论

如何在食管癌高发区癌前人群中确定癌变高危个体，继而实施高危个体的重点化学预防战略是整个食管癌研究中亟待解决的关键课题之一。本研究设计用分子流行病病例-对照及前瞻性研究的方法，拟在食管癌高发区人群中找出与早期癌变相关的分子生物学指标，以及它们在食管癌发生发展过程中的时相分布，进而随访观察其在癌前病变发展或转归中的意义，以确定出对早期癌变诊断有价值的指标。有研究报道p53及 ki67的过度表达与癌细胞早期癌变有关^［2］，本研究在较大食管癌前人群中探索p53及 ki67异常表达作为早期癌变指标的可能性。

我们采用免疫组织化学的方法在较大食管癌前样本中研究p53的表达改变，发现即使在轻度不典型增生中就已有 p53蛋白的轻度异常表达，且随着不典型增生程度的增加 p53蛋白聚集的频率也逐渐增加,原位癌时p53的阳性检出率达到70%，而正常组织中极少有 p53蛋白的聚集。这与Polkowski等^［3］报道的食管腺癌癌前病变中p53蛋白的表达情况相似。提示p53的改变与食管鳞癌的发生有关。用等级相关分析得出p53的表达程度与组织学分级呈正相关(r=0.3597，P＜0.001)，提示p53的改变在食管癌的癌变过程中起重要的作用。 p53阳性细胞的分布情况与增殖细胞分布相似：轻度不典型增生中，p53阳性细胞多在增生的基底层表达，随着不典型程度的加重，表达的细胞数逐渐增多并延伸到上皮的中层及浅层。提示基底细胞层可能是食管癌变的最早期位点。另外，本研究所采用的不典型增生的标本均取自无瘤个体，其表达的阳性率略低于其他人研究的取自癌旁的不典型增生组织中的表达^［4］，这更加支持p53改变可能是肿瘤发生的一个早期事件的论点。又因为p53异常表达程度与组织学分级相关，因此其可能作为在食管癌前人群中筛选高危个体的标志物。

本研究在正常组织中未发现Ki67表达，轻度不典型增生中Ki67的阳性表达率为40.5%，多在基底和副基底层表达，随着不典型增生程度的加重，Ki67表达率增高，原位癌时已上升到90%，且阳性细胞数逐渐增多到上皮的中层及浅层。等级相关分析结果Ki67表达程度与组织学分级之间呈正相关(r=0.5837，P＜0.001)。提示细胞增殖活性的改变在轻度不典型增生阶段就部分发生，且增殖活性的改变与癌变的过程相关。Ki67有可能作为食管癌前高危个体的检测标志物，进一步随访观察其在癌发生发展及化学预防转归中的作用。

本次研究还发现 p53蛋白与Ki67的表达间有很强的正相关性(r=0.5432，P＜0.001)，这与Sasano等^［5］的研究结果相一致，提示异常增殖的细胞中可能有p53的突变，二者可能对细胞癌变具有相互促进作用。同时，综合分析p53蛋白与Ki67的异常表达与癌变过程的相关性其显著性较单独分析为高(r=0.5897，P＜0.001)。提示二者联合起来作为筛选癌前高危个体的生物指标可能会更有意义。另外，本研究还发现重度不典型增生与原位癌组织中的 p53与Ki67的表达差异均无显著性意义，提示有必要在分子水平上对二者的本质差异作详细的研究。

基金项目：“九五”国家科技攻关项目（96-906-01-02）；国家自然科学基金资助项目（39870838)

作者单位：靳玉兰(100021中国医学科学院协和医科大学肿瘤所肿瘤生物检测中心)

张伟(100021中国医学科学院协和医科大学肿瘤所肿瘤生物检测中心)

通信作者：张伟0.543 2，P＜0.001)。

参考文献

1刘韵源.状态风险分析及其在生物医学中的应用. 北京:科学出版社,1990. 83-98.

2Jaskiewicz K, De Groot KM. p53 gene mutants expression, cellular proliferation and differentiation in oesophageal carcinoma and non-cancerous epithelium. Anticancer Res, 1994,14(1A):137-140.

3Polkowski W , van Lanschot JJ, Ten Kate FJ, et al . The value of p53 and ki 67 as markers for tumour progression in the Barrett's dysplasia-carcinoma sequence. Surg Oncol, 1995,4:163-171.

4Volant A, Nouabaum JB, Giroux MA, et al .p53 protein accumulation in oesophageal squamous cell carcinomas and precancerous lesions. J Clin Pathol,1995, 48: 531-534.

5Sasano H, Miyazaki S, Gooukon Y, et al. Expression of p53 in human esophageal carcimona :an immunohistochemical study with correlation to proliferating cell nuclear antigen expression. Hum Pathol, 1992,23: 1238-1243.