中国医学科学院学报2000年第22卷第4期

吕鸿雁李光涛周严金鉴蒋科艺彭小忠袁建刚强伯勤

摘要目的分离、克隆人泛素结合酶基因，并初步研究其组织表达谱。方法根据与鼠泛素结合酶有较高一致性的人表达序列标签(EST)设计筛库引物，筛选人胎脑cDNA文库，采用生物信息学方法分析筛选到的阳性克隆；设计探针，应用人多组织杂交膜分析该基因的组织表达谱。结果从文库中筛选到两个互为剪接异构体的长度分别为1471和1 315 bp的cDNA克隆，其开放读码框分别编码147和109个氨基酸，与鼠、果蝇、线虫等生物的泛素结合酶均高度同源，含泛素结合结构域，GenBank登录号分别为AF125044和AF125045。Northern杂交显示，该基因在成人心脏、胎盘、胰腺等组织中呈特异表达，而在脑、肝、肺、肾和骨胳肌中基本不表达。结论泛素结合酶基因在人体中的表达受到时间和空间的双重调控。

关键词：泛素；泛素结合酶

研究表明，越来越多的细胞调控机制与蛋白质的泛素修饰相关，其中包括细胞周期转换、I族抗原加工、信号转导通路及受体介导的内吞过程等^［1～4］。蛋白质的泛素化和去泛素化都需要由多种酶介导，因此泛素系统既具有高度底物特异性，又具有针对不同调控机制的调控多样性。蛋白质降解的泛素途径在多种真核生物中高度保守，并涉及泛素活化酶、泛素结合酶、泛素-蛋白连接酶等多种酶的作用^［5］。泛素相关酶在各种真核生物中均以家族形式存在。目前已分离出了几十种泛素结合酶，它们都含有16000的保守泛素结合(ubiquitin binding/conjugating, UBC)结构域，并在活性位点有一个半胱氨 酸残基^［6］。人的第一个泛素结合酶于1994年被分离和克隆，它来源于外周血淋巴细胞，在多种组织中广泛表达^［7］。

本研究利用与鼠泛素结合酶氨基酸序列有较高一致性的人表达序列标签(EST) 设计筛库引物， 采用 PCR 及杂交方法筛选 3 个月胎脑 cDNA文库， 分离、 克隆人泛素结合酶基因并初步研究其表达谱。

材料和方法

cDNA文库的筛选及测序由NCBI genBank数据库中查到鼠泛素结合酶氨基酸序列，根据该氨基酸序列应用TBLASTN程序比较人EST，其中EST a1039109与鼠泛素结合酶氨基酸序列高度同源。根据该EST设计筛库引物：正向5′-TCCCTCCTTGTGTTCTAGTC-3′，反向5′-CTGCTGCAGAACCACATCC-3′。

采用PCR技术扩增人胎脑cDNA文库^［8］，反应条件为94℃预变性3 min， 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 循环30次， 72℃延伸10 min。 PCR产物经电泳分离和胶回收后， 以［α-³²P］dCTP(亚辉生物科技公司)标记制备成探针，按常规杂交方法筛选阳性克隆^［9］。 第一轮得到17个克隆。又经再次筛选得到多个阳性单克隆。 将λ噬菌体在XLORL菌体内环化为质粒，经酶切初步分析插入片段大小； 挑选插入片段最大的2个克隆，质粒经扩增后进行DNA序列分析(测序由上海博亚公司完成)。 cDNA全长序列通过设计引物步移得到。

cDNA克隆的序列分析及同源性比较将cDNA序列及预测的氨基酸序列与GenBank数据库内的序列进行同源性比较^［10］，并用DNAMAN程序进行人、鼠、果蝇和线虫泛素结合酶序列的多序列排列比较分析^［11］。

Northern杂交分析将筛库探针与分别载有人心、脑、肝、肾、肺、胎盘、胰腺和骨骼肌mRNA的多组织膜(Clontech公司)杂交，并以β-actin作上样量对照。

结果

cDNA全长序列与编码氨基酸的分析结果所筛选到的人泛素结合酶cDNA的全长序列及由其推测的氨基酸序列见图1、2。序列1长度为1471 bp，含444 bp长的开放读码框，编码的蛋白质含147个氨基酸，推测其相对分子质量为16300，第137～139个核苷酸为起始密码子，其邻近序列与Kozak序列(ANNATGG)一致^［12］，3′端有典型的AATAAA加尾信号；序列2长度为1315 bp，含327 bp长的开放读码框，编码的蛋白质含109个氨基酸，相对分子质量约为12000，第98～101个核苷酸为起始密码子，其邻近序列同样符合Kozak原则，3′端也有典型加尾信号。

将上述两序列的氨基酸顺序与线虫、果蝇、大鼠、小鼠的同源蛋白进行比较，结果显示上述蛋白质的同源性很高(图3)，并且都含有泛素结合结构域。

组织表达谱分析多组织Northern印迹分析显示，克隆的基因在人的心脏、胎盘和胰腺中呈特异表达，转录本大小约为1.3 kb,且在心脏中还有少量较小转录本，与所得到的cDNA克隆长度相符(图4)。

图 1人泛素结合酶序列1 cDNA全序列及其编码情况

fig 1The full length and coding region of human ubiquitin binding enzyme cDNA1*stop codon； ● tailing signal

图 2人泛素结合酶序列2 cDNA全序列及其编码情况

fig 2The full length and coding region of human ubiquitin binding enzyme cDNA2* stop codon； ● tailing signal

图 3线虫、果蝇、大鼠、小鼠、人泛素结合酶序列1和序列2的氨基酸多序列排列比较

fig 3Multiple alignment of the amino acid sequences of the ubiquitin binding enzymes from C.elegans,dros-ophila,rat,mouse and human

the black box represents the ubiquitin binding domain and the light box represents other identical sequences

图 4人泛素结合酶基因的Northern杂交结果

fig 4Northern blot result of human ubiquitin binding enzyme gene

m.molecular weight marker;1.heart;2.brain;

3.placenta;4.lung;5.liver;6.skeletal muscle;

7.kidney;8.pancreas

讨论

基因表达调控涉及多个步骤，一般认为主要集中在转录水平，但不同蛋白质有不同的生命周期，因而翻译成熟后蛋白质的降解也是影响基因表达调控的关键之一。真核细胞中蛋白质的泛素化是影响其最终降解的关键步骤。受泛素化调控的蛋白质越来越多，包括细胞周期调节因子、转录因子、磷酸酯酶以及抑癌基因产物等^［3］。

蛋白质的泛素降解途径涉及4种酶家族：泛素活化酶、泛素结合酶、泛素-底物连接酶及去泛素酶，它们均以多种异构体形式存在。本实验所得到的2个人泛素结合酶(E2)克隆，经序列比较发现，二者互为剪接异构体。序列1中的第225～256位核苷酸在序列2中被作为内含子切除，其余部分完全相同。GenBank于1999年8月7日公布了该基因的基因组序列，其登录号为AC004985，全长159507 bp。序列比较表明，序列1是由7段外显子拼接而成，序列2中外显子3被切除并发生了读框移动。

多种生物的泛素结合酶序列比较显示，该基因非常保守，这也间接表明其功能的重要性，这一点与多基因家族的存在是一致的。细胞内有大量不同的蛋白质分子，它们不可能由同一种泛素酶进行催化，必然要求具有同一功能的多种酶分子的存在，以保证不同的底物特异性，它们之间的功能是不可替代的。可变剪接是真核生物中影响翻译产物功能的重要机制之一，本实验所克隆到的这2个泛素结合酶的剪接异构体是否具有不同的底物特异性及其生物学意义还需进一步验证。

研究表明，已有1条人泛素结合酶基因UBE21被定位到16号染色体短臂13.3位置上^［5］，该基因与本实验所克隆基因的蛋白产物的同源性是93%，一致性是59%。

泛素分子作为蛋白降解的辅助分子，在细胞中广泛存在。而本实验所克隆的泛素结合酶基因仅在心脏、胎盘、胰腺中有特异表达。推测其原因可能是由于胞内存在多种不同的泛素结合酶，虽然泛素分子可能不具有组织特异性，但泛素结合酶基因却受到严格调控，不同的基因在不同的组织中表达，从而保证对蛋白质降解过程的精细调控。另外，该基因只能从胎脑文库中分离获得，只在胎盘中有表达，而在成人脑中却检测不到其转录本的存在。可见这种泛素结合酶基因的表达除了受到组织特异性调控外，还受不同发育时间的调控。

国家自然科学基金(39830070),国家高技术研究发展计划863重点项目基金(Z19-02-02-01),国家重点基础性研究973项目基金(G1