中华病理学杂志2000年第29卷第4期

张晶尤红王泰龄

关键词：肝；细胞凋亡；TUNEL复合染色

已知肝内除肝细胞可以发生凋亡外，增生的小胆管上皮细胞、肝非实质细胞如星状细胞、枯否细胞等均可发生细胞凋亡。它们对维持肝内细胞间的平衡，胶原纤维的沉积与降解均发挥着重要的作用^［1］。为了研究肝病组织中各种细胞凋亡的发生发展及形态学改变，我们应用较为灵敏的TUNEL法在石蜡切片中原位检测细胞凋亡。由于肝窦中细胞成分较多，为了同时鉴别发生凋亡细胞的类别，在TUNEL法基础上附加显示相应细胞的特异免疫组织化学或辅以特殊染色，并以2种TUNEL试剂盒与免疫组织化学做对应的染色，选择具最佳显示效果的方法。

一、材料与方法

1. 材料：(1)酒精性肝病尸检肝组织2例；组织取材于日本医科大学附属病院；(2)实验性胆管阻塞性肝纤维化模型（造模后6周）大鼠4只。

2．试剂：TUNEL检测试剂盒(Boeringer Mannheim公司)，包括碱性磷酸酶标记和辣根过氧化物酶标记两种；抗体为α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和KP-1单克隆抗体（Zymed公司产品），分别用以显示肝星状细胞和枯否细胞；用改良Masson三色法^［2］染色衬托肝组织结构及纤维化程度。

3. 方法：（1）酒精性早期肝硬化尸检肝组织4%甲醛固定，石蜡包埋，切片厚4～5μm，均做连续切片，依所用TUNEL试剂盒的不同分为A、B 2组：A组：TUNEL试剂盒为碱性磷酸酶标记（分3步）。①TUNEL检测：切片脱蜡后，3% h₂O₂作用15 min，PBS液洗3×5 min，蛋白酶K 20 μg/ml消化30 min，PBS洗3×5 min，TUNEL反应液37℃孵育60 min，PBS洗3×5 min，AP液37℃孵育30 min，PBS洗3×5 min，五溴-四氯-三吲哚磷酸酶/氮蓝四唑（BCIP/NBT）显色，显微镜下控制显色程度。②免疫组织化学染色：先以PBS洗3×5 min，3% H₂O₂室温作用10 min，PBS洗3×5 min，10％正常小牛血清封闭10 min，其后切片分别滴加一抗α-SMA(1∶50)或KP-1(1∶50)，室温孵育1 h，PBS洗3×5 min，滴加生物素标记的二抗工作液，室温作用15 min，PBS洗3×5 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温15 min，PBS洗3×5 min，DAB显色，水洗。③改良Masson三色法对比染色。B组：TUNEL试剂盒为辣根酶过氧化物标记，染色步骤与A组相同，以DAB显色。其后的免疫组织化学应用碱性磷酸酶标记，BCIP/NBT显色。（2）胆管阻塞性肝纤维化大鼠模型肝组织石蜡包埋、切片同上，以碱性磷酸酶标记的TUNEL检测后，Masson三色法做对比染色。

二、结果

1．A组：凋亡细胞核呈深蓝色，肝星状细胞、枯否细胞胞质呈棕色，酒精性肝纤维化及早期肝硬化伴轻度慢性肝炎组织中，可见较多的肝细胞凋亡（图1）；肝星状细胞在肝内呈弥漫性增生，增生活化的肝星状细胞，核大，偶见双核，胞质突起较长，沿窦壁延伸，周围有胶原纤维沉积，随纤维化的加重，肝星状细胞密集，TUNEL阳性的肝星状细胞较少见（图2）；Kp-1染色显示肝窦内枯否细胞弥漫增生，数目明显增多，胞体肥大，胞质呈棕色，细胞形状不规则有突起，胞质内可见吞噬空泡，而且TUNEL阳性细胞核较易见。这有2种情况：（1）枯否细胞本身的凋亡较少见；（2）吞噬凋亡小体，被吞入凋亡小体周围均有大小不等空泡，可与本身凋亡相区别（图3）。

图1凋亡的肝细胞，胞核呈阳性，可见肝窦中枯否细胞噬入凋亡小体TUNEL+Masson染色×800

图2增生的肝星状细胞凋亡，胞核阳性呈深蓝色，细胞突起呈棕色，沿窦壁伸延，窦周有胶原纤维沉积（绿色）

TUNEL（NBT/BCIP显色）＋α-SMA（DAB显色）＋Masson染色×1 000

图3增生的枯否细胞中，可见有吞噬的凋亡小体及枯否细胞自身凋亡TUNEL＋KP-1×400

2．B组：凋亡细胞胞核DAB显色呈棕色，较为清晰。但肝星状细胞及枯否细胞胞质经碱性磷酸酶标记的免疫组织化学染色NBT显示后效果不佳，特别是α-SMA染色，肝星状细胞虽有大量增生，但仅有纤维隔中的部分细胞胞质被显示出来，且细胞不清晰，结构不完整。大量增生肥大的枯否细胞，胞质为深蓝色，因有泛化现象，有些细胞边界不清。

3．胆管阻塞性肝纤维化模型，胆小管上皮呈立方形，核大，一个增生的胆小管中可见1～3个TUNEL阳性细胞，其正常结构消失，呈深蓝色，并可见凋亡小体脱落于小胆管腔中（图4）。

图4大量增生的小胆管，部分胆管上皮细胞凋亡，核呈蓝色TUNEL＋Masson染色×1 000

三、讨论

1．组织动力学研究表明，如能观察到很少的细胞凋亡即意味着已清除大量凋亡细胞。一旦这种识别机制受损，凋亡细胞不能被吞噬细胞及时清除，就会引起组织结构和功能的损害^［3］。我们在酒精性肝病研究中观察到枯否细胞大量增生，胞质中有被吞噬的凋亡小体，肝细胞的凋亡数量也明显多于慢性肝病肝硬化组织及慢性肝炎肝穿组织。凋亡的肝星状细胞较少。活化增生后的肝星状细胞有两种命运：一是回到静止状态，二是可能通过凋亡等途径而死亡^［4］，其中的凋亡途径不但可以减少增生活化的肝星状细胞数量，而且凋亡的细胞可在数小时内被周围的细胞所吞噬，很少引起微环境的损伤，因此它是一种理想的清除增生肝星状细胞的方式^［5，6］。

2．肝窦中有多种细胞成分，经TUNEL法原位检测细胞凋亡后，如不采用显示相关细胞的免疫组织化学双重染色加以鉴别，就不能证实肝窦中的凋亡细胞为何种细胞。因此，TUNEL检测后，辅以显示肝星状细胞的α-SMA^［1］和显示枯否细胞的KP-1免疫组织化学染色，再复染Masson染色，可以将肝细胞、肝星状细胞、枯否细胞及胶原沉积程度显示出来。这对于明确判断肝窦中的凋亡细胞成分及相关病变十分有利。

3．在TUNEL复合染色中，A、B 2组凋亡细胞显示均较清晰，分别显深蓝色及褐色，但在结合特定的免疫组织化学及特殊染色之后，则以A组切片的染色效果为佳，即凋亡细胞显深蓝色，肝星状细胞、枯否细胞为棕色，肝细胞核为紫红色、胞质为粉色，红细胞为黄色、胶原纤维绿色。可以清晰显示肝窦中的凋亡细胞与其他病理改变之间的关系。B组切片除凋亡细胞显示较清晰外，因免疫组织化学采用碱性磷酸酶标记，肝星状细胞及枯否细胞的显示均不完整，特别是肝星状细胞仅在纤维隔中有较弱的阳性信号显示。这是因为BCIP/NBT发色团较粗大，与阳性位点的结合不够稳定，特别是能够部分溶解于有机溶剂，导致阳性细胞着色变浅或完全褪色。对于肝星状细胞等这类胞质纤细的细胞及间质成分以DAB显示的更加清晰、准确。

4．根据不同观察目的需要，在同一张切片中显示出多种特定细胞成分的方法已经倍受重视，如适用于碱性磷酸酶的显色系统已经具有红、紫、棕、蓝等4种颜色，而适用于辣根过氧化物酶的显色系统也有红、棕2色，亦可在DAB中添加金属离子镍等来加强显色，使其成为黑色。随着技术条件的不断完善，这些方法都为病理诊断以及相关研究提供了更加便利的条件^［7］。

作者单位：张晶（100029北京，中日友好医院病理科)

王泰龄（100029 北京，中日友好医院病理科)

尤红（北京友谊医院肝病中心）

参考文献

［1］Iredale jP, Benyon RC, Pickering J, et al. Mechanisms of spontaneous resolution of rat liver fibrosis. Hepatic stellate cell apoptosis and reduced hepatic expression of metalloproteinase inhibitors. J Clin Invest，1998，102: 538-549.

［2］张晶，吴，王泰龄.显示肝脏早期纤维化染色方法的探讨. 中日友好医院学报，1991,5:148.

［3］彭黎明.吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬.中华病理学杂志，1999，28：304-306.

［4］Richard A. Life or death: the fate of hepatic stellate cell following hepatic injury. Hepatology，1998，27: 1447-1448.

［5］范建高，徐正婕. 细胞凋亡与酒精性肝病. 肝脏，1999，4:34-35.

［6］尤红，王宝恩，王泰龄，等.肝星状细胞的增生和凋亡及复方861对其干预作用的研究.中华肝脏病杂志，2000，8:2.

［7］Van der Loos CM，Becher AE, Van den Oord JJ. Praclical suggestions for succ