中华肝脏病杂志2000年第8卷第2期

陆伦根曾民德李继强华静马雄茅益民邱德凯萧树东

摘要目的 探讨脂质（三酯酰甘油和极低密度脂蛋白）对HSC前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA表达的影响。方法 链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流，Nycodenz密度梯度离心分离大鼠HSC，分别用三酯酰甘油（25mg/L）和极低密度脂蛋白（25mg/L）共孵育10 d后，提取HSC的RNA，用Northern blot杂交观察三酯酰甘油和极低密度脂蛋白对HSC前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA表达。结果 HSC经三酯酰甘油和极低密度脂蛋白刺激后其前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA表达均明显增加。结论 脂质可增加前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA表达,与脂肪肝肝纤维化的发生有关。

关键词：蛋白脂质类；肝星状细胞；mRNA，溶胶原

我们曾观察到脂质（三酯酰甘油和极低密度脂蛋白）对HSC的增殖作用[1]，本实验进一步研究脂质对HSC前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA 表达的影响。

材料与方法

1.前胶原α2（Ⅰ）和前胶原α2（Ⅲ）cDNA质粒的扩增和抽提：前胶原α2（Ⅰ）和前胶原α2（Ⅲ）cDNA重组质粒分别克隆于 PUCAUI 的 PstⅠ/EcoRⅠ和 HindⅢ/ EcoRⅠ位点，长度分别为670bp、705bp。重组质粒扩增后，经碱变性法提取质粒 DNA。

2.前胶原α2（Ⅰ）和前胶原α2（Ⅲ）cDNA探针的制备：探针标记用随机引物法，Digoxigenin-11-dUTP购自德国 Boehringer Mannheim公司，探针制备按试剂盒推荐的方法进行。

3.Wistar 雄性大鼠 HSC 的分离、培养和鉴定：参照文献[1, 2]。

4.脂质刺激后 HSC 总 RNA 抽提：新分离的 HSC 以 1×105/cm2 接种于5 0ml 培养瓶，分别加入三酯酰甘油（浓度为 25mg/L，Sigma公司产品）和极低密度脂蛋白（浓度为 25mg/L，南京医科大学动脉粥样硬化中心提供），置5% CO2、95% 空气培养箱中（37℃)，24h 细胞贴壁后换液， 3d更换一次培养液，至第 10天收集 HSC，分别提取其总 RNA，High pure RNA Isolation Kit 为德国 Boehringer Mannheim公司产品，按试剂盒推荐的方法进行。

5.Northern 杂交：提取的总 RNA 65℃变性后电泳，再转移至尼龙膜上，80℃干烤，42℃预杂交２h。将 cDNA 探针（60～100ng/ml）变性５min，冰浴骤冷，加入适量杂交液后，42℃振荡杂交16h 以上。用2×SSC 0.1% SDS 洗涤后，加入1：5000碱性磷酸酶标记的地高辛抗体室温２h，然后加入 BCIP 和 NBT混和物置暗处显色至效果满意，洗涤后晾干，观察结果。

结 果

1.HSC细胞的得率和纯度：用本法分离的 HSC，其得率为每鼠肝 5×106～1×107个细胞，以 0.4% 台盼蓝染色，细胞存活率在 98％以上。原代培养的 HSC Desmin 阳性在 90％ 以上，传代培养后 HSC desmin 阳性在 98％ 以上。

2.HSC 总 RNA 的提取结果：用本试剂盒提取的 RNA Ａ260/Ａ280比值在 2.0 左右， RNA浓度合乎要求。经甲醛变性电泳后，紫外灯下清晰可见 28S 及18S 条带，表明样品无降解，能满足实验的要求。

3.脂质对 HSC 前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA 表达的影响：与正常 HSC相比，经三酯酰甘油和极低密度脂蛋白刺激后 HSC 前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA 表达均明显增加，见图 1和图 2。

图1三酯甘油处理的HSC前胶原I mRNA Northern杂交

图2极低密度脂蛋白处理的HSC前原III mRNA Northern杂交

讨 论

mRNA的转录调节是胶原合成的最主要调节,胶原合成的变化最早反映在 mRNA 的水平变化。HSC的激活增殖是各种原因引起肝纤维化形成的中心环节，因此研究 hSC中胶原基因的表达对了解肝纤维化的发生机制有重要的意义。

人们对真核细胞 DNA复制的调控了解甚少，胶原基因表达亦不例外。胶原的基本结构是由３条α链（包括２个α1链和１个α2链）构成的三螺旋结构,三螺旋结构区域的基因有 44 个外显子[3]。另外研究还发现胶原基因α1(Ⅰ)、α2(Ⅰ)和α1(Ⅲ) 型胶原基因的启动区域都存在“TATA盒”和“CAAT盒”序列[3]。由于在基因启动子区域结构上的相似性，Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的调节多有一致性[4]。我们观察到HSC经三酯酰甘油（25mg/L）和极低密度脂蛋白（25mg/L）刺激后，HSC的前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA表达均明显的增加，我们在以前的实验中亦观察到脂质（三酯酰甘油和极低密度脂蛋白）及其刺激的 kupffer 细胞培养的上清液均对 HSC 增殖有促进作用[1, 2]，这些结果表明脂质可能与 hSC激活、增殖及脂肪肝肝纤维化的形成有密切关系，其作用可能与脂质过氧化反应有关。Weiner等[4]研究发现正常新分离的 HSC 与肝损伤后或培养的HSC产生前胶原 mRNA 水平Ⅲ 型较Ⅰ 型高，但培养７d后，Ⅰ型胶原 mRNA 增加 17 倍，Ⅲ 和 Ⅳ型胶原分别增加３倍和 2.6倍，这些变化提示HSC激活和增殖过程中产生胶原的总量及种类均发生改变，这种变化与肝纤维化的发生密切相关。在多种肝纤维化模型中已出现 tGFβ1 mRNA 表达增加，TGFβ1 不仅引起Ⅰ型胶原产生增加外，亦可引起Ⅲ和Ⅳ型胶原及纤维连结素和蛋白多糖等细胞外基质合成的增加[5]；血小板源生长因子可促进 HSC的增生，亦可使胶原形成增加，且这种作用可被抗血小板源生长因子抗体所抑制。而这些细胞因子对 hSC胶原基因的表达及调控影响的因素较多，就目前来说，细胞内 mRNA的水平除转录水平的调节外，还有转录后、受体、后受体水平的调节，转录后mRNA的稳态性受到多种因素的影响。因此，具体机制仍需进一步研究。

国家自然科学基金(No.39670339)

陆伦根,男,34岁,医学博士,副教授,主编和参编专著5部,发表论文近40篇,获上海市科技进步奖1项,其他各类奖8项

陆伦根（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所)

曾民德（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所)

李继强（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所)

华静（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所)

马雄（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所)

茅益民（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所)

邱德凯（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所)

萧树东（20001上海第二医科大学附属仁济医院、上海市消化疾病研究所）

参考文献

［1］陆伦根, 曾民德, 李继强,等. 甘油三酯和极低密度脂蛋白对肝星状细胞增殖的影响.中华肝脏病杂志, 1998, 6: 241-242.

［2］Lu LG, Zeng MD, Li JQ, et al. Effects of Kupffer cells stimulated by triglyceride and very low-density lipoprotein on proliferation of rat hepatic stellate cells. Chin Med J, 1999, 112: 325-329.

［3］Garcia-Trevijano ER, Iraburu MJ, Fontana L, et al. Transforming growth factor betal induces the expression of alpha(Ⅰ) procollagen mRNA by a hydrogen peroxide-c/EBP beta-dependent mechanism in rat hepatic stellate cells. hepatology, 1999, 29: 960-970.

［4］Weiner FR, Giambrone MA, Czaja MJ, et al. Ito-cell gene expression and collagen regulation. Hepatology, 1990, 11: 111-117.

［5］Ikeda H, Nagoshi S, Ohno A, et al. Activated rat stellate cells ecpress c-met and respond to hepatocyte growth factor to enhance transforming growth factor betal expression and DNA synthesis. Biochem Biophys Res Commun, 1998,250: 769-775.