军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

蔡欣段聚宝邹民吉王嘉玺

关键词：酵母；PCR；克隆

甲基营养型毕赤酵母巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是目前较为有效的外源基因表达系统，可实现目的蛋白的高效分泌表达，且可对目的蛋白进行糖基化加工等^［1］。毕赤酵母表达系统利用的是乙醇氧化酶基因（Aox1）启动子作为强诱导型启动子，可被甲醇诱导。宿主菌GS115在His4基因位点被突变，因而只有当携有外源基因和His4基因的表达载体（如pPIC9或pHIL-S1）与酵母染色体在Aox1基因处发生同源重组后，酵母克隆才能在组氨酸缺陷培养基（MD）平板上生长。而此时由于酵母基因组上Aox1基因被取代，重组克隆仅能利用Aox2缓慢代谢甲醇（Mut^s），表现为在MM平板上生长缓慢。因而一般采用MD/MM平板筛选法来筛选重组酵母克隆。但由于至少10%～20%的转化子是载体His4基因和GS115染色体上的His突变基因位点间的转换而形成，因而这种所谓的重组克隆并不携有载体上的目的基因表达序列^［2］。这种假阳性的克隆的排除只有用PCR方法来鉴定目的基因是否存在于酵母染色体上。传统提取酵母染色体的方法较为繁琐且耗时较长^［3］，而其他相对简便的方法中则需使用酵母裂解酶处理^［2］。我们采用了一种新的快速制备酵母染色体的方法，通过PCR鉴定重组酵母克隆，排除了MD/MM平板筛选出的假阳性克隆。

1材料与方法

1.1菌株、培养基及试剂

重组酵母表达载体pPIC9-Endo含有编码人血管内皮细胞生长抑制素(endostatin)的基因片段^［4］，为本室构建。GS115(His^-)为本室保存。酵母培养基的配制参照文献［2］。

1.2MD/MM平板法筛选重组酵母克隆

参照Invitrogen公司的说明书。从转化平板上挑取菌落，先后接种于MM/MD平板上。2 d后观察菌落生长状况，在MM平板上生长缓慢而在MD平板上长得较大的克隆视为重组酵母克隆。

1.3酵母染色体DNA的快速制备

从MD平板上用牙签挑取少许酵母菌，悬浮于50 μl无菌水中。100℃煮沸10 min，离心取上清。加入0.5倍体积的7.5 mol/L NH₄Ac(pH7.5)和2倍体积的无水乙醇，混匀后在-20℃放置30 min。4℃，12 000 r/min离心5 min，吹干沉淀，并溶于10 μl无菌水中。

1.4PCR反应

取1.3中制备的染色体溶解液5 μl作为模板DNA，各加入1 μl引物（对应于人endostatin的序列），加入4μl2.5 mmol/L dNTP，0.5 μl Taq酶（华美生物工程公司产品），加水补齐反应体积至50μl。反应参数为：94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。在Perkin-Elmer公司的PE2400型PCR仪上进行PCR反应。

1.5琼脂糖凝胶电泳

配制1%的琼脂糖凝胶检测PCR产物。参照文献［5］进行。

2结果

2.1MD/MM平板法筛选重组酵母克隆

利用MD/MM平板对转化子进行初步筛选，发现约90%的转化子在MM上生长缓慢（图1）。这些克隆可视为重组酵母克隆。

图1MD/MM平板法初步筛选重组酵母克隆

2.2PCR快速鉴定重组酵母克隆

随机选取MD/MM平板法筛选出的8个阳性重组酵母克隆，挑取少许菌落快速制备模板DNA，进行PCR检测。由图2可见，8个克隆中只有5个克隆的PCR检测反应中可扩增出约550 bp的目的基因片段，也就是说只有这5个克隆的基因组中真正整合了目的基因片段。

图2PCR鉴定重组酵母克隆

1～8.8个酵母克隆的PCR产物；

9.DNA分子量标准物λDNA/HindⅢ

3讨论

利用PCR鉴定重组大肠杆菌克隆在原核基因工程中已很常用^［6］，而本文提供了一种结合PCR扩增的简便、快速、经济的鉴定重组酵母克隆的方法。此方法的一个重要特点是模板DNA-酵母基因组DNA的制备简单、经济，仅需要热处理和简单的乙醇沉淀、浓缩，其优点在于：（1）毋需专门的裂解酶来处理酵母细胞；（2）毋需抽提基因组DNA，在0.5 h内即可快速制备好染色体DNA；（3）可同时筛选大批重组克隆；（4）结果可靠。我们曾借鉴一种直接鉴定重组大肠杆菌克隆的方法^［6］，模板采用简单的微波炉加热煮沸，直接取裂解上清作为 pCR扩增的模板，但效果不佳，可能因为酵母裂解液中某些成分干扰了PCR反应。

经本方法鉴定的重组酵母克隆经诱导培养后，均可分泌表达人endostatin(另文发表)。所以，在进行表达测试前用这种方法对重组克隆进行鉴定将可排除一些假阳性克隆。另外，如果不经MD/MM平板筛选，而直接对MD平板上的转化子进行这种PCR筛选和鉴定，也是一种十分有效和快速的方法。

［作者简介］蔡欣(1975-)，女，江苏泰兴人，助理实验师。

蔡欣(军事医学科学院基础医学研究所, 北京100850)

段聚宝(军事医学科学院基础医学研究所, 北京100850)

邹民吉(军事医学科学院基础医学研究所, 北京100850)

王嘉玺(军事医学科学院基础医学研究所, 北京100850)

参考文献

［1］Cregg JM,Vedvick tS,Raschke WC.Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris[J].Bio/Technology,1993,11(8):905.

［2］Linder S,Schliwa M,Kube-Granderath E.Direct PCR screening of Pichia pastoris clones[J].Bio Techniques,1996,20(6):980.

［3］Holm C,Meeks-Wagner DW,Fangman WL,et al.A rapid efficient method for isolating DNA from yeast[J].Gene,1986,42(2)"169.

［4］段聚宝,蔡欣,张宝林,等.人血管内皮细胞生长抑制素的基因克隆及表达[J].军事医学科学院院刊,1998,22(4):304.

［5］Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual[M].2nd ed.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.1.21.

［6］宋新荣,任启生.用聚合酶链式反应法筛选重组阳性克隆[J].中华微生物与流行病学杂志，1992,13（2）:360.