军事医学科学院院刊2000年第24卷第2期

侯春梅毛宁

关键词：逆转录病毒科；转染

Flt3-ligand（FL）是近年来新发现的一种细胞因子，属于I型穿膜糖蛋白，具有膜结合型和分泌型两种不同的表达形式。FL与IL-3、IL-6、SCF及GM-CSF等细胞因子协同刺激造血干/祖细胞增殖，因而在造血干/祖细胞的体外培养中获得了广泛应用。FL及G-CSF协同作用能够动员造血干/祖细胞进入外周血，另外，FL还具有抗肿瘤的作用。

人和小鼠FL基因在基因组中的结构十分相似，它们在核酸水平上有76%的相似性，在氨基酸水平上有72%的相似性。人FL可作用于小鼠细胞，产生与小鼠FL相同的生物学效应。为了研究FL在造血过程中的作用，我们将人FL基因导入小鼠骨髓基质细胞系TC-1，表达人FL，以便于在体内和体外实验中研究FL的造血调控作用。

1材料和方法

1.1构建载体

将人FL cDNA克隆到逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点上，构建含人FL的重组逆转录病毒质粒pLFLSN。

1.2细胞培养

包装细胞PA317购自美国ATCC，NIH3T3细胞由本室保存，TC-1细胞由中国科学院血液研究所宋增璇教授惠赠，细胞均培养于含10%血清的DMEM培养液中。

1.3包装逆转录病毒颗粒

接种PA317细胞于6孔板中，至对数生长期用脂质体法转基因。分别取10μl脂质体脂染胺(lipofectamine，购自美国Gibco/BRL公司）和5 μg重组质粒pLFLSN及空载体pLXSN作对照，依照Lipofectamine的使用说明转染PA317细胞。转染48 h后加入终浓度为1 mg/ml的G418筛选。得到的阳性细胞于32℃中培养，收集病毒上清。

1.4检测病毒滴度

以NIH3T3细胞作为靶细胞，加入病毒上清和终浓度为8 μg/ml的聚凝胺(Polybrene)进行感染，G418筛选，2周后在显微镜下数集落，计算滴度。

1.5逆转录病毒颗粒感染靶细胞TC-1

以病毒上清替换TC-1的培养液，加入终浓度为8 μg/ml的Polybrene，培养24 h后换液，48 h后加入1 mg/ml的G418筛选，构建转基因细胞TC-1/FL。

1.6检测TC-1/FL细胞中FL mRNA的表达及其在基因组中的整合

细胞总RNA应用Trizol试剂（购自美国Gibco/BRL公司）提取，基因组DNA用Promega公司基因组DNA提取试剂盒提取。FL左侧引物5′-ATGACAGTGCTGGCGCCAG-3′，右侧引物5′-TCACGGGGCTGTCGGGGC-3′。Trizol提取的细胞总RNA，在M-MLV逆转录酶（购自Promega公司）的作用下进行逆转录反应，然后进行30循环的PCR反应，条件如下：94℃预变性5 min，每个循环94℃ 30 s，62℃ 45 s，72℃ 50 s，最后72℃延伸10 min。同时扩增202 bp的β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照。

1.7检测转基因细胞TC-1/FL中FL蛋白的表达及活性

间接ELISA检测TC-1/FL培养上清中FL的浓度：细胞培养上清包被酶联板，封闭后加入小鼠抗人FL单克隆抗体作用（购自Genzyme公司），洗涤后加入HRP标记羊抗小鼠二抗，洗涤后加入OPD显色，酶联仪检测。

2结果和讨论

通过酶切鉴定，获得含人FL的重组逆转录病毒质粒pLFLSN。转染PA317细胞，在G418的筛选下部分存活细胞为转基因的阳性细胞，收集病毒上清，测得pLFLSN和pLXSN转染后的病毒滴度分别是5.1×10⁴和1.8×10⁴。

提取的TC-1/FL细胞基因组DNA通过PCR扩增到了人FL基因，表明FL已整合在靶细胞基因组中。提取的TC-1/FL细胞总RNA进行RT-PCR，电泳结果表明细胞中有FL mRNA的表达。间接法ELISA检测到TC-1/FL细胞培养上清中FL的浓度为46.4 ng/(ml^．10⁶细胞^．48 h)。经单克隆化获得上清中FL的浓度分别为82.7，44.1，32.5，18.2，9.8 ng/(ml^．10⁶细胞*48 h)的单克隆细胞株。转基因细胞在冻存后复苏仍能分泌FL，在培养2个月后，上清中FL的浓度稳定为39.2 ng/(ml^．10⁶细胞^．48 h)。

目前，在基因转染领域有各种各样载体，其中逆转录病毒载体由于能够整合在靶细胞的基因组中，并在靶细胞中长期稳定表达目的基因的特点而被广泛采用。我们应用逆转录病毒载体pLXSN将人FL基因导入到小鼠基质细胞系TC-1中，使FL基因整合到靶细胞中，并在其中长期稳定表达FL。人FL由于能够同样作用于人细胞和小鼠细胞的特点，可以用于小鼠实验，这样，我们构建的转染人FL的小鼠基质细胞可用于研究FL在体内外的造血调控作用。

［作者简介］侯春梅(1963-)，女，山西太原人，实验师。

侯春梅(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)

毛宁(军事医学科学院基础医学研究所，北京100850)

参考文献

［1］Shurin MR，Esche C，Lotze mT.FLT3:receptor and ligand.Biology and potential clinical application［J］.Cytokine growth Factor Rev，1998，9(1)：37.

［2］Song ZX，Shadduck RK，Innes DJ，et al.Hematopoietic factor production by a cell line (TC-1) derived from adherent murine marrow cells［J］.Blood，1985，66(2)：273.