中国矫形外科杂志2000年第7卷第10期

孟国林胡蕴玉

关键词：基因治疗；骨科；治疗

基因治疗是随着对遗传性疾病认识的深入和分子生物学技术的发展而诞生的。基因治疗概念的提出是在80年代初期，随后获得了飞快的发展。90年代初期，随着世界首例腺苷脱氨酶(ADA)缺乏性重症免疫缺陷病的治疗获得了成功^［1］，基因治疗获得了临床治疗的批准，并进而推动了其他一些疾病的基因治疗的发展。基因治疗的早期概念是向靶细胞引入外源性基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。但随着基因治疗技术的发展，基因治疗已经不再局限于治疗遗传性基因缺陷性疾病，所以目前它的概念应当是：将外源基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗目的。近年来，研究人员已经开始使用基因治疗一些骨科疾病，并取得了一些阶段性成果，本文仅就近几年来基因治疗在骨科疾病治疗中的探索性研究成果做一综述。

1基因治疗在骨折治疗中的应用

骨折是目前常见的创伤性疾病，许多患者由于全身性或局部性的原因导致骨折不愈合或骨不连。对于骨折不愈合或骨不连，目前临床上多采用手术治疗的方法，通过坚强内固定、消除不稳定因素等方法达到治疗目的。随着骨诱导理论的提出，人们发现骨形态发生蛋白对未分化间充质细胞具有独特的诱导其向成骨细胞方向转化并进而形成新骨的作用^［2］。目前，骨形态发生蛋白已经在临床应用于治疗骨折和骨不连获得了满意的疗效^［3］。受此理论的影响，目前已经有将BMP基因转染不同的受体细胞以期望达到治疗骨折或骨不连的目的^［4～6］。

1994年，Takaoka等^［4］将从Dunn鼠骨肉瘤中提取的BMP-4cDNA转染到中国仓鼠卵巢细胞中，然后将转染后的细胞放在扩散盒内并植入裸鼠皮下，在植入后3周，在构成扩散盒的醋酸纤维素膜的外面有新骨形成。而在对照组，即装有没有转染细胞的扩散盒的外面则没有新骨形成。转染的细胞经培育形成肿瘤，将这些肿瘤组织匀浆、脱脂后再植入到裸鼠皮下，这些没有细胞的组分3周后在植入的局部仍可形成新骨，对照组仍不具有骨诱导活性。Takaoka的实验说明了两个问题，(1)BMP-4具有骨诱导活性，(2)将BMP-4的基因转染到靶细胞后，靶细胞可表达有活性的BMP-4蛋白，更重要的是靶细胞表达的BMP-4的量非常大，足以在局部诱导形成新骨。

1996年，马庆军^［5］将BMP-1全长DNA插入到pRc/RSV质粒中，构建成BMP-1的真核表达载体pRc/RSV/BMP-1，然后将100mg这种载体采用注射法注射到大鼠股四头肌内，在手术后三周，通过免疫组织化学方法检测到在注射部位有BMP-1的表达。他的实验虽然并没有在局部形成新骨，但是却打开了尝试采用基因转染的方法治疗骨折的先河，具有重要的意义。

1998年Lieberman等^［6］将BMP-2基因转染进入鼠骨髓基质细胞内，用可表达重组BMP-2cDNA的腺病毒感染骨髓基质干细胞可分泌具有生物活性的BMP-2。这些BMP-2分泌性基质干细胞在移植到股四头肌时可诱导异位骨形成并可在裸鼠成功的使股骨骨段的缺损得到完全的治愈。该实验证明，在特殊解剖部位使用可连续产生骨诱导因子的基因治疗可促进骨形成和骨折的治疗。

2基因治疗在关节炎治疗中的应用

关节炎特别是类风湿性关节炎是临床上较为难以治疗的疾病之一，对患者的致残性很强。从发病机理上来说，免疫因素发挥着非常重要的因素，即同白细胞介素类物质有着重要的关联^［7］。1996年，Ghivizzani等^［8］采用间接转染法将IL-1β基因转入关节滑膜细胞，表达阳性的滑膜细胞在回植到兔关节腔内后，检测发现关节滑液内的IL-1β表达水平增高，同时实验关节出现明显的炎症反应，表现为白细胞渗出增多，关节滑膜肥厚、增生和软骨血管翳形成等类风湿关节炎的表现。以后，随着关节滑液内IL-1β水平的下降，局部炎症逐渐缓解。该实验证明了类风湿关节炎同某些免疫因子之间的联系。目前基因治疗也主要是集中在通过抑制这些免疫介质表达而抑制该疾病的发生方面。

1998年，Ghivizzani等^［9］向抗体诱导的患有关节炎的兔关节腔内注射IL-1-R-1g-G和/或TNF-R-1g-G融合蛋白基因，发现，当向关节腔内注射一种融合蛋白时，接受IL-1受体的一侧关节软骨基质的降解速度有显著降低，浸入关节腔内的白细胞数量明显下降。单独使用TNF-α受体时效果较差，且对关节软骨的降解无抑制作用。但当两者联合使用时，关节腔内白细胞侵入和关节软骨降解的抑制效果更强，较单独使用时效果明显的高。非常有意思的是，非实验侧的关节炎病理表现也明显的受到了抑制，说明基因表达产物通过血液循环到达了另一侧。这同样也说明局部关节内的基因治疗可用于治疗多发性关节炎的治疗。

退行性骨关节炎从病理学上可表现为关节软骨细胞合成蛋白多糖和Ⅱ型胶原能力的减退，导致关节软骨抗磨损能力减弱和软骨的破碎，从而出现病变关节的疼痛。因此，通过增强关节软骨细胞表达蛋白多糖或/和Ⅱ型胶原的能力并成为治疗骨关节炎的一种选择。1997年，Arai等^［10］以腺病毒为载体将TGF-β和热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)转染入人软骨样细胞HCS-2/8。发现目的基因在受体细胞内的表达可持续到转染后21d。转染的TGF-β1基因可促进软骨细胞内Ⅱ型胶原和蛋白多糖核心蛋白mRNA的表达，但同时抑制基质金属蛋白酶-3(MMP-3)mRNA的表达；HSP70的表达也较高，且表达的HSP70可增加蛋白多糖核心蛋白mRNA的表达。以上研究表明，通过转染促进关节软骨细胞表现型表达的生长因子基因来治疗骨关节炎是可行的。

3骨科肿瘤的基因治疗

肿瘤基因治疗的目的是通过外源基因的导入，激活机体抗肿瘤免疫、增强对肿瘤细胞的识别能力、抑制或阻断肿瘤相关基因的异常表达，或增加肿瘤对药物的敏感性^［11］。这些基因主要包括：(1)细胞因子，(2)主要组织相容性复合物(MHC)，(3)抗肿瘤基因，(4)肿瘤药物相关基因，(5)信息药物，(6)病毒基因等。最近对肿瘤的治疗又增加了一种新的方法，即通过基因治疗，抑制肿瘤的营养供应，将肿瘤细胞“饿死”^［12］。随着基因治疗的发展，这一技术也在骨科肿瘤的治疗中得到了探索性的应用。1999年，Grossin等^［13］将单纯疱疹病毒载体-胸腺嘧啶脱氧核苷激酶基因(HSV1-TK)转染入人骨肉瘤细胞系。实验发现，体外培养的人骨肉瘤细胞在接受了这种自杀基因后，对更昔洛伟(ganciclovir, gCV)异常敏感，很容易被杀死。随后，Charissoux等^［14］又做了体内实验。他们将小块骨肉瘤组织种植在兔胫骨的旁边，7d后向肿瘤组织内注射包装细胞(psiCRIP-TK和psi cRIP-LLZ)，随后使用GCV治疗。结果显示本该在这一时间发生肿瘤肺脏转移的兔却安然无恙，同时发现肿瘤体积较以前减小了。这一研究结果显示，在治疗骨肉瘤这种增殖速度比较快的肿瘤过程中，基因治疗可能会发挥着重要的作用。由于恶性肿瘤的治疗基本可不考虑社会伦理问题，加上临床治疗的迫切需要，相信随着研究的深入，其他骨科肿瘤，比如：Ewing氏瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤等恶性程度较高的肿瘤均可通过基因治疗改善患者生存质量，延长生存期。

4周围神经再生与防治肌肉萎缩中基因治疗的策略

周围神经损伤后神经自身修复能力有限，由于各种神经营养因子不能及时运送到相应支配的肌肉，必然出现肌肉的萎缩。尽管显微外科技术发展迅速，但周围神经的修复效果仍不理想。采用基因治疗的方法或许会成为一种有效的手段。基因治疗的策略^［16］是将外源性神经营养因子的基因转入相应的神经、肌肉中，使之表达、分泌大量神经营养因子，促进神经再生和防止肌肉萎缩。肌肉细胞可能会在其中发挥重要的作用，因为神经营养因子既可营养肌肉，又可逆向运输至运动、感觉神经元胞体而发挥作用。实验证明，肌肉细胞由于为不可分裂细胞，逆转录病毒载体介导的基因转移对肌肉细胞几乎无效，但其突出的特点是可采用直接体内基因转移，即将DNA直接注射入肌肉细胞而达到基因治疗目的^［17］。Wolff^［18］曾将外源基因直接注射入肌肉细胞，发现外源基因可长期在该细胞内停留和表达。目前，基因治疗在周围神经再生和防治肌肉萎缩方面的研究尚在探索阶段。

5基因治疗在其他骨科疾病中的应用的展望和存在的问题

骨质疏松是一种老年性退行性疾病，目前发病率随着社会老龄化问题的日益严重而逐渐增高。由于病因复杂，涉及的因素多，主要病理生理过程还未完全搞清楚，使该疾病的治疗目前还主要是停留在口服成骨性药物的阶段。我们预测，随着基因学和信息学的发展，骨质疏松的诊断和治疗将会发生革命性的进展。据预测，遗传推算技术将会在许多人尚未发展到骨质疏松的时候即可被确诊，从而可提前采取预防性措施。通过促进一些成骨性因子的基因在患者体内的表达来增加骨骼的成骨能力，或许会在骨质疏松的治疗中发挥一定的作用^［15］。另外，随着人们对各种生长因子功能和相互间作用的认识，使用各种因子的基因来治疗各种软组织。如：韧带的损伤、遗传性结缔组织疾病。如：Ehlers-Danlos综合征以及肌肉营养不良等将成为可能。

尽管基因治疗前景宜人，但目前也存在一些难以解决的问题，比如社会伦理学问题，特别是在一些非致命性疾病的基因治疗中显的尤其有争议。另外，