第三军医大学学报2000年第22卷第4期

杜楠裴雪涛罗成基李梁邹仲敏冯凯白慈贤孙兵

摘要： 目的探索辐射诱导基因调控元件启动的造血生长因子表达及其对造血恢复的作用。方法该实验将携带Egr-1调控序列启动的FLT3配基(FL)和GM-CSF双顺反子表达载体(Egr-FG)导入骨髓基质细胞系HFCL(称为HFCL/EFG)。采用RT-PCR、ELISA及细胞增殖法观察FL和GM-CSF cDNA在转染细胞中的表达及保护造血作用。结果构建了Egr-1调控序列启动的双顺反子基因表达载体(Egr-FG)；在HFCL/EFG细胞中证实有外源性FL和GM-CSF基因的整合和表达，在辐照后16 h的HFCL/EFG细胞培养上清液中，FL和GM-CSF含量较照射前明显增高( p＜ 0. 01)；同时证实辐射后HFCL/EFG培养上清液对造血祖细胞有明显扩增作用；共培养的骨髓有核细胞和HFCL/EFG经照射后7 d计数非粘附细胞，HFCL/EFG组较对照组明显增加(P＜ 0.05 )。结论辐射诱导基因Egr-1调控序列启动的造血生长因子基因表达载体在辐射后表达明显增高，在体外对辐射后的造血细胞具有保护作用。

关键词：辐射诱导基因；造血生长因子；基因治疗；辐射；骨髓基质细胞

电离辐射可迅速诱导细胞中早期生长反应(Early growth resp onse,Egr-1)基因的表达，Egr-1基因启动子含有6个CArG元件，电离辐射通过细胞产生活性氧自由基作用于CArG元件，诱导Egr-1的表达。最近Weichselbaum等^［1］将该启动子诱导的基因疗法与放射治疗结合起来(Gene-radiatherapy)，证明用特异的辐射诱导元件Egr-1启动子经辐射可诱导下游基因超强表达。现已证明造血生长因子具有抗辐射及促进造血恢复作用，GM-CSF和FL(FLT3 Ligand)是作用于造血细胞不同阶段的细胞因子^［2］，我们设想采用Egr-1调控序列启动造血因子基因(GM-CSF和FL)的表达载体导入骨髓基质细胞，然后对其进行辐射诱导Egr-1启动子下游基因表达，以促进造血恢复的抗辐射作用。

1材料与方法

1.1重组载体的构建

将FL cDNA (pUC18/FL由Indiana大学Dr Wang LS提供)和GM-CSF cDNA (pMX/GM-CSF由 dr Donnell MD惠赠)，分别用IRES(pIRES)连接，再重组于携带Egr-1调控元件的pCIneo载体上(北京放研所吕星博士惠赠)^［3］，然后，构建成pCIneo-Egr-1R-GM-CSF-IRES-FL载体(Egr-FG)及各对照组载体。

1.2细胞培养及转染

人骨髓基质细胞系HFCL^［4］用含10%小牛血清的DMEM培养，待细胞呈对数生长时，用无血清DMEM培养液洗涤1次，然后用脂质体介导质粒DNA转染，用G418选择阳性克隆称为 hFCL/EFG。采用免疫磁珠法(MACS，Miltenti Biotec Germany)分离CD34⁺细胞^［5］，在含20%FCS、50 ng/ml SCF、20 ng/ml IL-3及20 ng/ml IL-6的IMDM(GIBCO)培养基中，均在37°C及5%CO₂条件下。

1.3RT-PCR检测^［6］GM-CSF和FL cDNA表达

取HFCL/EFG细胞，用RNA提取试剂盒，按说明方法分别提取总RNA。合成GM-CSF、FL及β-actin基因序列引物。FL的PCR产物为225 bp，P1 5'-CTT GGA CCC AGC GAC aGT CTT G -3',P2 5'-TGC TGC TGA GCT CGG GAC TC-3',GM-CSF的PCR产物为495 bp，P15'-GCG GAT CCG CTG GAG GAT GTG GCT G, P2 5'-ATGAAACAAGAGCTAGAAACTCAGG;β-actin引物的P cR产物为249 bp，P1 5'-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT A G-3'，P2 5'-TTG TAA CCA c CT GGG ACG ATA TGG-3'；RT-PCR用cDNA合成试剂盒及方法合成cDNA，再用上述引物进行P cR，94°C 60 s,68°C 60 s,72°C 120 s共30次循环。

1.4GM-CSF和FL表达量检测

取经2.5 Gy辐射后消化的培养细胞，按1×10⁵细胞接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，用PBS洗涤3次，用无血清IMDM培养第8 h换液并收集细胞培养上清液，每种样品重复3孔，作时间曲线图，用人GM-CSF ELISA试剂盒(晶美生物工程有限公司)及FL多抗(Santa cruz公 司)按常规方法测定GM-CSF和FL含量。

1.52.5 Gy照射后细胞培养上清液对脐血CD34⁺细胞的体外扩增

培养体系中含30%的2.5 Gy照后16 h的转染细胞培养上清、12.5%HS、12.5%FCS、5×10^-6mol/L氢化可的松、CD34⁺细胞5×10³/孔及其它细胞因子(SCF50 ng/ml+IL-3 20 ng/ml+IL-6 20 ng/ml)，阳性对照为标准品FL(Immunex) 40 ng/ml及无培养上清的上述体系，对照组为未照射或无细胞因子的上述培养条件，7 d后，用流式细胞仪或荧光 显微镜分析CD34^＋细胞数量。

1.6HFCL/EFG对2.5 Gy辐射后骨髓细胞的影响

取正常人肋骨骨髓分离单个核细胞(MNC)，分别加入MNC(1×10⁴/孔)和HFCL/EFG(1×10³/孔)，其它培养体系同方法1.5，给予2.5 Gy ⁶⁰CO照射，常规培养7 d计数每孔非粘附细胞。

2结果

2.1载体的构建及转染骨髓基质细胞

构建过程见图1。经限制性内切酶分析鉴定证明Egr-1基因调控序列连接双顺反子GM-C sF cDNA和FL cDNA于携带Egr-1启动子的真核表达载体pCIneo上，并筛选出正向重组子。然后将其用脂质体转染骨髓基质细胞系HFCL，经G418抗性筛选出阳性细胞克隆HFCL/EGF。

图1Egr-1调控的GM-CSF和FL cDNA双顺反子表达载体的构建

fig 1Schematic representation of the recombinant GM-CSF and

fL cDNA bicistronic eukaryotic expression vector

2.2GM-CSF和FL的含量检测

2.5 Gy 辐射后16 h转染细胞培养上清液ELISA检测显示HFCL/EGF培养上清液FL和GM-CS f含量照射后明显增加，未照射组FL含量为(214.45±35.61) pg/ml，GM-CSF为(15.60±3.23) pg/ml，照射组FL为(805.46±107.21) pg/ml，GM-CSF为(485.56±81.14) pg/ml， 两组比较，P＜ 0.01。

2.3辐照后HFCL/EFG培养上清液对CD34⁺细胞增殖的影响

液体培养结果FL标准组：(207.66±34.03)×10³/ml，照射组为(174.46±22.11)×10³/ml，未照射组为(71.62±10.22)×10³/ml，结果表明：FL与其它细胞因子联合应用具有短时间内可扩增早期造血祖细胞的作用，而HFCL/EFG细胞经照射后其培养上清也具有扩增祖细胞的作用，且比未照射组更强(P＜ 0.05)。

2.4照射的HFCL/EFG细胞对骨髓有核细胞数量的影响

hFCL/EFG与骨髓有核细胞共培养后，经辐射后含有Egr-1启动子的HFCL/EFG细胞较未含有该启动子的细胞对辐射损伤的造血细胞具有促进其恢复和增殖的作用(P＜ 0.05)，见图2。

图2照射后HFCL/EFG对骨髓有核细胞(MNC)的保护作用

fig 2Protective effects of HFCL/EFG on MNC post-radiation

2.5RT-PCR检测GM-CSF及FL cDNA在细胞中的表达

用RT-PCR方法检测HFCL/EFG细胞中外源基因mRNA转录，见图3。

图3RT-PCR检测HFCL/EFG细胞中GM-CSF和FL mRNA表达

fig 3RT-PCR for expressions of GM-CSF and

fL mRNA in HFCL /EFG

lane 1:Marker 100 bp DNA ladder； Lane 2,3,4:Expressions of FL m RNA and β-actin mRNA in HFCL/EFG; Lane 5: Expression of β-actin mRNA in HFCL ; Lane 6,7: expression of GM-CSF mRNA and β-actin mRNA in HFCL/EFG; Lane 8: P CR Marker

3讨论

造血干/祖细胞属于更新活跃、增殖旺盛的细胞，具有很高的辐射敏感性，电离辐射所致造血损伤的主要环节是造血祖细胞增殖能力的丧失或抑制，而造血微环境是造血调控的关键，造血微环境主要由基质细胞、细胞外基质和造血因子组成。GM-CSF是一种具有广谱活性的造血生长因子，它不仅对多系造血祖细胞的增殖与分化是必需的，而且对多种成熟血细胞的生存和发挥其功能也必不可少，临床研究证明GM-CSF可提高受照患者的存活率、减轻造血组织辐射损伤，并使感染和出血易于控制。FL(FLT3 Ligand)是最近发现的一种主要促进早期造血干/祖细胞增殖的细胞因子，是一种早期造血的关键性调节因子，与GM-CSF协同，效果更佳，随后发现FL与其它细胞因子相比具有更强的辐射后造血保护作用及更广阔的临床应用前景<