中华内科杂志2000年第39卷第6期

孙凯冯琦金伯泉

关键词：CD（cluster of differentiation, CD）；CD/Ig融合蛋白

自80年代以来，由于单克隆抗体、分子克隆等技术的发展，使得免疫细胞膜表面分子的研究进展十分迅速。免疫细胞膜表面分子包括大量重要的抗原、受体或其他分子，其中绝大部分属于CD分子。充分认识这些分子的结构、特性、分布及功能，对于透彻理解免疫应答规律是至关重要的。人类白细胞分化抗原国际协作组会议将识别同一分化抗原的来自不同实验室的单克隆抗体归为一个分化群，简称CD（cluster of differentiation, CD）。到目前为止，人类白细胞分化抗原的国际协作组会议共举行了6次，CD的序列号已至CD₁₆₆^［1］。CD抗原可以分为9个组，包括T细胞、B细胞、髓样细胞、NK细胞、血小板、活化抗原、黏附分子和细胞因子受体等。从另一个角度划分，CD分子又包括许多重要的黏附分子、免疫球蛋白超家族成员，它们广泛参与免疫活性细胞识别抗原，充当某些免疫活性物质的受体，介导细胞与基质间的黏附，介导机体的免疫应答，参与炎症、造血调控、创伤愈合、凝血、肿瘤发生和转移等重要的生理和病理过程^［2］。

免疫球蛋白（Ig）融合蛋白是指在基因水平将目的蛋白基因同Ig部分片段基因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述2部分结构域的重组蛋白。由于目的蛋白同免疫球蛋白部分结构域融合，使重组蛋白获得了多种新的特性：(1)引入的重链稳定区CH结构域使重组蛋白具有更长的半衰期，更适合于体内的应用。(2)通过抗Fc段亲和层析、葡萄球菌A（G）蛋白可以方便地进行纯化及免疫共沉淀实验。(3)由于存在大量商品化的与Fc段配套的产品，使融合蛋白的检测更加方便、特异、敏感。(4)Fc段具有穿过胎盘、结合补体并介导补体依赖的细胞毒作用，介导ADCC效应等，这一特性被应用于某些疾病的靶向性治疗。(5)不同Ig（IgG、IgM、IgA）Fc结构域可以形成多聚体分子，提高重组蛋白结合抗原或配体的能力。由于上述两方面的因素，CD/Ig融合蛋白被广泛应用于细胞膜表面分子结构与功能研究。以下对几种主要的CD/Ig融合蛋白研究概况作一简介。

1.CD₄/Ig： CD₄为膜表面糖蛋白，胞膜外区具有4个IgV样结构域，属免疫球蛋白超家族。HIV病毒能通过与CD₄分子的第1个IgV样区结合而感染CD⁺₄ t细胞，并最终导致获得性免疫缺陷综合征。为了利用CD₄的这种特性治疗HIV感染，Chamow等^［3］制备了CD₄/IgG融合蛋白，包括CD₄胞膜外区第1、2结构域、人Ig重链绞链区及Fc段，这种重组蛋白能与HIV-1病毒结合，阻断HIV的感染过程，其体内半衰期较长，能通过Fc段发挥活化补体及抗体依赖细胞介导的ADCC作用，并能有效穿过胎盘对胎儿起到防护作用。在对16例AIDS患者进行的I期临床验证中，患者最大耐受为1000 μg/kg，未发现有严重的毒性反应^［4］。Traunecker等将CD₄分子与不同亚类的免疫球蛋白重组，用CD₄氨基端的2个结构域替换小鼠IgG_2a或IgM的VH和CH1区，CD₄/IgM比CD₄/IgG的抑制作用要强1 000倍以上，而且融合蛋白获得了结合Fc受体、结合补体成分Clq的功能^［5］。Allaway等^［6,7］将人IgG₂重链及轻链可变区用人CD₄的第1、2结构域替换，这样构建的四聚体能以nM级的亲和力结合于纯化的gp120蛋白。药代动力学显示CD₄/IgG₂融合蛋白在试验动物（兔）体内半衰期在1 d以上，而可溶性CD₄分子半衰期仅为15 min。CD₄/IgG₂不能与细胞膜表面的Fc段受体结合，因此它不会产生抗体依赖的增强病毒感染作用。在细胞融合实验中，CD₄/IgG₂四聚体抑制合胞体形成的能力明显强于可溶性CD₄分子，而且CD₄/IgG₂在较低的浓度下能有效中和多种HIV病毒株。在hu-PBL-SCID模型中，每kg体重给予10～50 mg融合蛋白能有效保护实验动物免于HIV感染，其保护作用明显强于HIV抗体（多克隆抗体在150 mg/kg水平仍只有部分保护作用），有进一步应用于体内的可能性。

Zettlmeissl等^［8］在真核细胞内表达了人CD₄胞膜外区与人不同Ig重链稳定区的融合蛋白，这些融合蛋白能抑制HIV感染及HIV介导的细胞毒作用。作者制备的含绞链区CD₄/IgG₁分子能有效结合于HIV的gp160蛋白及人Fc受体，并具有补体辅助的抑制病毒传播的作用。小鼠及猴体内实验证实重组CD₄/Ig融合蛋白半衰期长于可溶性的CD₄分子。

MT-4为人T细胞系，对HIV-1高度敏感，在MT-4感染HIV-1后，用4μg/ml的CD₄/Ig即能完全阻断HIV-1诱导的特异性细胞病理学改变、抗原表达及病毒颗粒的释放，能完全抑制HIV诱导的合胞体形成。此融合蛋白在1μg/ml的浓度下即能阻断HTLV-III/B和YU-1对外周血单个核细胞的感染。将Fc受体阳性的U937细胞用CD₄/Ig融合蛋白预先处理，可以抑制HIV的感染（95%）。Chowdhury等^［9］认为CD₄/Ig融合蛋白有希望用于HIV的治疗。

嗜碱性粒细胞及肥大细胞是IgE介导的I型变态反应的主要效应细胞，它们参与抗寄生虫、抗病毒及抗细菌免疫。Krauss等^［10］构建的CD₄/IgE融合蛋白包括CD₄氨基端的2个结构域及IgE重链的CH_2-4结构域，这种重组蛋白能与gp120蛋白结合，其同嗜碱性粒细胞膜表面高亲和力受体及淋巴细胞膜表面低亲和力受体的亲和力同天然IgE无明显差异。同时，融合蛋白中CD₄结构域同gp120的结合特性也与天然CD₄相似。在实验中发现，用CD₄/IgE“武装”的嗜碱性粒细胞能在HIV病毒或HIV感染细胞的诱导下释放介质。作者进一步证实HIV结合的嗜碱性粒细胞使易感性T细胞内病毒的复制减弱。上述结果表明I型超敏反应的效应细胞及CD₄/IgE有希望应用于HIV的治疗。

Batra等^［11］将假单胞菌属外毒素PE₄₀引入CD₄分子，制备了CD₄-PE₄₀融合蛋白，为了增加融合蛋白在血清中的半衰期，作者将IgG₁重链稳定区重组入CD₄-PE₄₀融合蛋白，构建了CD₄-CH₂-PE₄₀、CD₄-CH₃-PE₄₀、CD₄-CH₁-CH₂-PE₄₀及CD₄-CH₂-CH3-PE₄₀融合蛋白。融合蛋白在大肠杆菌中表达并纯化，插入的IgG₁稳定区对CD₄-PE₄₀的毒性无影响。这些融合蛋白对表达gp120蛋白的细胞具有相同的毒性。在CD₄-PE₄₀中插入IgG₁稳定区增加了融合蛋白的半衰期，其中以CD₄-CH₂-PE₄₀半衰期最长，为115 min。

2.CD₂₈/Ig与CTLA-4/Ig：免疫应答需要T-B细胞间的相互作用。CD₂₈能通过与B7的相互作用活化B细胞。CD₂₈和B7的反应也是T细胞活化的一个共刺激信号，TCR复合物及CD₂₈介导的信号是T淋巴细胞活化所必须的。CD₂₈分子表达于95%的CD⁺₄和50%的CD⁺₈T细胞膜表面，它是由2条Mr44×10³的多肽链通过二硫键形成的同源二聚体，分子量约为Mr90×10³，属免疫球蛋白超家族成员，CD₂₈与CTLA-4高度同源，其配体包括B7-1（CD₈₀）及B7-2（CD₈₆）。

Linsley等^［12］表达了B7和CD₂₈/Ig融合蛋白，并证实¹²⁵I标记的B7/Ig能结合于CD₂₈转染的CHO细胞，抑制CD₂₈介导的细胞黏附，并刺激T细胞增殖，而B7+ cHO能增加T细胞IL-2的转录水平，证实CD₂₈信号通路能被B7激活，导致T细胞细胞因子分泌的增加、T细胞的增殖。由于CTLA4与CD₂₈高度同源，因此，大多研究者都采用CTLA4/Ig融合蛋白代替CD₂₈进行共刺激信号分子的研究。T细胞的活化需要2种信号，第一是T细胞受体与抗原提呈细胞的MHC复合物相互作用的信号，另一个为共刺激信号，如表达于抗原提呈细胞的B7抗原及表达于T细胞上的CD₂₈分子。重组的CTLA4/Ig融合蛋白能以高亲和力结合于B7分子，通过CTLA4/Ig融合蛋白阻断CD₂₈/B7的反应能在体内及体外抑制T细胞的活化。在MHC匹配的小鼠角膜移植模型中应用CTLA4/Ig（腹腔注射300μg CTLA4/Ig）能延长移植物的存活^［13］。

在器官移植前对供体器官进行基因修饰可能是抑制或控制移植物抗宿主病的一个有效方法。Oral等^［14］通过重组腺病毒载体对角膜细胞进行了CTLA-4/Ig基因转染，在转染后第28天仍能检测到角膜细胞培养上清液中有融合蛋白的表达。表达的融合蛋白具有生物学活性，能结合CD₈₀分子。在噬齿类模型中，选择性地通过B7特异性的融合蛋白CTLA4/Ig抑制T细胞共刺激信号能延长异体移植物的存活时间，抗CD₄₀及其配体CD₄₀L的抗体与CTLA4/Ig具有协同作用。在恒河猴模型中，CTLA4/Ig与CD₄₀L特异性抗体协同作用要比它们单独作用时效率高100倍。在肾移植实验中，对照组的排斥反应时间为5～8 d，单独应用CTLA4/Ig或CD