第三军医大学学报2000年第22卷第2期

叶治家程天民江智红李伯良

摘要目的：为了表达人ACATC端片段并制备其抗体。方法：将编码人ACAT羧基端包含第二跨膜(463-550氨基酸残基)的cDNA片断克隆至不同的大肠杆菌表达载体中，构建了系列表达质粒，并在多种大肠杆菌中进行了表达研究。结果：在详细探索表达条件的基础上，经温敏诱导，成功地在大肠杆菌AR68中表达了N端融合 proteinABCdomain的人ACAT羧基末端包含第二个跨膜区的片段，表达量约20mg/L菌液。通过优化纯化条件，经Sepharose4B-IgG亲和层析柱分离纯化得到表达产物，并制备获得其阳性抗血清。结论：这些工作为进一步表达完整的 ACAT蛋白、研究ACAT基因表达调控及其结构与功能的关系奠定了基础。

关键词：酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶；羧基端片段；融合表达；抗体

酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶（Acyl-coenzymeA： cholesterolacyltransferase，ACAT；EC2.3.1.26）催化胆固醇与长链脂肪酸形成胆固醇酯。ACAT在体内胆固醇的吸收、运输、贮存等过程蟹⒒蛹渲匾淖饔茫堑鹘谔迥?胆固醇代谢平衡的关键酶之一［1］。遗传及细胞生物学实验表明，高胆固醇血症引起动脉管壁ACAT活性升高，导致巨噬细胞内胆固醇酯大量堆积，形成泡沫细胞，是动脉粥样硬化症发生的早期事件［2］； ACAT突变可能导致智力低下。因此，对ACAT的研究越来越引起重视。ACAT的概念早在1958年就被提出来了，其在细胞内主要分布在粗面内质网膜上，且含量极低，遇去垢剂易失活，分离纯化极其困难［3］。使得对 ACAT的研究，多年来停留在细胞水平。1993年美国Dartmouth医学院T.Y.Chang实验室，利用ACAT缺陷的突变CHO细胞株AC29克隆了人ACAT的cDNA［4］，从而把ACAT的研究带入分子水平。 Chang［1］用抗ACATN端的抗体，经Westernblotting分析，检测ACAT在体内的分布，结果出现分子量约45×103u单一的条带［5］，明显小于理论分子量65×103u，这是否存在C端缺失还不得而知。有实验结果表明ACATknockout小鼠，其成纤维细胞、巨噬细胞以及肾上腺组织中胆固醇酯的合成明显减少，提示在这些组织细胞中，ACAT在其胆固醇酯合成过程中起重要作用。但在肝脏胆固醇酯的合成基本不受影响，并且体内糖皮质激素的水平也无明显变化。表明在小鼠体内存在具有ACAT样活性的其它酶蛋白分子。计算机分析得知，在已知的cDNA库中找到多种 与ACATC端具有同源结构的序列［6］。因此，重组表达ACAT c端片段并制备相应的抗体，对研究ACAT结构与功能的关系以及寻找ACAT的同工酶或类似物有十分重要的意义。目前，有关ACAT的C端表达及其抗体制备均未见有文献报道。我们在进行大量表达及纯化条件摸索的基础上，在大肠杆菌中成功表达了与葡萄球菌蛋白A bCdomain(ProteinABC,PABC)融合、包含第二个跨膜区的ACATC端片 段（PABC-ACATc），经亲和层析纯化得到表达产物。再用纯化的表达产物免疫大白兔制备了相应的抗血清 。

1材料与方法

1.1质粒、菌种

包含人ACATcDNAK1的质粒pACAT15L由美国Dartmouth医学院T.Y.Chang实验室惠赠；表达载体pMFLV3、pBLPAV7、pBLSPV3及大肠杆菌 BL21(DE3)、MC1061、AR68、RR1等均由中国科学院生物化学研究所220组保存。

1.2酶、化学试剂

DNA限制性内切酶、Klenow酶、T4DNA连接酶购自Biolabs,丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)为Fluka产品 ，PMSF购自BoehringerMannhein，Sephrose4B-IgG本实验室自制，新西兰大耳兔购自中科院实验动物中心，其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.3细菌培养、质粒抽提、酶切反应、DNA电泳鉴定及回收、连接反应、质粒转化

按文献［7］进行。

1.4蛋白质分析

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳按Laemmli［8］方法进行。

1.5Westernblotting分析

按本实验室常规方法进行。

1.6外源基因的表达

重组表达质粒转化大肠杆菌AR68,接种单个菌落于2LB/AP培养液,32℃培养过夜，取过夜菌按20％接种量接种于新鲜2LB/AP培养液，32℃培养2～3h，再在42℃继续培 养1、2、3、4、5h，进行温敏诱导表达，取样测OD600值，离心收集菌体，按每0.1OD菌加10μl水及等体积的SDS- PAGE上样缓冲液（2倍母液）悬浮菌体，煮沸5min，取20μl进行SDS-PAGE电泳分析，鉴定有无表达。

1.7表达产物溶解性分析

收集表达菌，按每0.1OD菌加5μl缓冲液A(20mmol/LTris· hClpH7.8,2mmol/LEDTA,1mmol/LPMSF)悬浮细菌，超声波破菌，15000 r/min,4°C,离心15min，严格分离上清和沉淀，上清中加入等体积的SDS－PAGE上样缓冲液（2倍母液），沉淀悬浮在与上清等体积的水及SDS-PAGE上样缓冲液（2倍母液）中，煮沸5min，分别取20μl样品上样进行SDS-PAGE分析，确定表达产物的溶解性。

1.8表达产物的纯化

收集50ml表达菌，将其悬浮于2ml缓冲液A中，超声破菌，用等体积的缓冲液A稀释，18000r/min(4°C)离心20min，保留上清。取约150μlSepharose4B-IgG树脂，预先用缓冲 液A（bufferA）平衡，将破菌上清与树脂混旋(4℃)2h，按生化所220组常规方法进行亲和层析，以bufferA代替PBS，收集最后一步洗脱液，－80℃冻结，冷冻干燥，取样 进行SDS-PAGE分析。

1.9抗体制备

取冷冻干燥样品2mg溶解在bufferA中，进行SDS-PAGE电泳，挖胶取表达产物条带，置－80℃30min，低温下磨碎 ，用bufferA（不含PMSF）悬浮，与等体积的佛氏完全佐剂乳化。按常规方法免疫新西兰大耳兔，初次免疫 后1、2个月各加强免疫1次。

1.10抗体特异性分析

取全菌蛋白电泳样品，用SDS-PAGE上样缓冲液稀释20倍，取20μl样品进行SDS－PAGE，用制备的抗体按常规方法 进行Westernblotting分析。

2结果

2.1表达质粒的构建

表达质粒pBLPAV7和pBLPAV8是在PLPromoter控制下的系列高效融合表达载体，表达产物N-端融合ProteinABCdomain,便于 用IgG固相柱亲和纯化。为了校正阅读框架，先用EcoRⅠ和HindⅢ从包含全长ACATcDNA的质粒中切出表达ACAT第二跨 膜及C端cDNA的片段（266bp），补平后与经SmaI酶切的表达载体pBLPAV8连接，筛选获得重组质粒pBLPAV8-ACATC；再用 EcoRⅠ和BamHⅠ从pBLPAV8-ACATC切出约266bp的DNA片段，与用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切的表达载体pBLPAV7连接，获得ACATC融合表达 质粒pBLPAV7-ACATC。构建流程见图1。

图1ACATc表达质粒的构建Fig1ConstructionofexpressionplasmidpBLPAV7-ACATc

2.2融合ProteinABCdomain的ACATC端片段在E.coliAR68中的表达

将构建的表达质粒转化到不同的表达菌中，进行表达研究，仅观察到pBLPAV7-ACATC表达质粒转化在AR68菌株中有相应的表达条带，分子量约27×103u(与理论推算值 相符)。从诱导时间看，42°C诱导1h就能观察到表达条带，且表达量最高，表达量约占全菌蛋白的1％(20mg/L)。其后表达量减少见图2。

图2ACATc表达产物SDS-PAGE分析Fig2SDS-PAGE analysis of the expression products from AR68 harboring the plasmid pBLPAV7-ACATc

lane1：Total bacterial proteins from cellsincubated at 32℃;

lane2～6：Total bacterial proteins from cells incubated at42℃ for1,2,3,4,5 hours;

lane7：Protein molecular weight marker

2.3表达产物的可溶性分析及其纯化

可溶性分析表明，表达产物约20％为可溶性蛋白。根据表达产物N端融合有ProteinABCdomain的特点，用Sepharose 4B-IgG亲和层析纯化表达产物。表达产物极不稳定，纯化的样品中有明显的降解条带。按常规的方法纯化，几乎得不到表达产物,纯化样品主要为降解产物 (结果未列出)。为了抑制表达产物的降解，诱导表达结束后，立即在菌液中加入蛋白酶抑制剂PMSF，终浓 度为2mmol/L，并置冰浴30min。在其后的操作过程中，以缓冲溶液A代替PBS缓冲溶液。这样，表达产物降解的现象被明显抑制。经亲和层析，可得到纯度达50％的表达产物见图3。

图3ACATc表达产物经Sepharose4B-IgG亲合层析后纯化样品的SDS-PAGE分析Fig3SDS-PAGE analysis of the expression products purified by Affinity Chromatography with sepharos