第三军医大学学报2000年第22卷第1期

张伟（综述）王登高（审校）

关键词：热休克转录因子；结构；功能

热应激反应（Heat shock response）最早由Ritossa（1962）在研究黑腹果蝇时发现^［1］。随后，许多学者对其进行了深入研究，发现众多生物，包括动物、植物、细菌等，都具有这一特性。随生物化学及遗传学技术进步，热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）及热休克基因被逐渐发现和探明。迄今，HSP的结构及在热应激反应中的功能已较为清楚，其“分子伴娘”（Molecular charperone）^［2］的身份已广为人知。同时，热应激反应的调节也逐渐受到研究人员的重视。

1HSF的发现

鉴于热休克蛋白(HSP)在热应激反应中的关键作用，对热应激反应调节的研究主要集中在HSP及其基因（ Heat shock gene）表达的调节上。到八十年代中期，研究证明热休克基因表达的调节主要发生在转录水平^［3］，此后研究工作重点便集中于寻找调节热休克基因转录的热休克依赖性转录因子。后来在E.coli体内，发现了 热休克σ因子（Heat shock σ factor）^［4］。但是，与σ因子同源的调节因子在原核生物中并不普遍存在，其它细菌的调节另有机制。在枯草杆菌（Bacilluss ubtilis）体内，热休克基因的表达则受到一个重复DNA序列的可逆的顺式负调节（Negative cis-acting control）。所以原核生物的热应激反应调节机制中，迄今尚无一个共同的调节 因子。

早在70年代中期，研究人员就发现，用热休克细胞的提取物能诱导果蝇染色体的热休克位点出现所谓 的“染色体疏松”（Chromosome puff），说明真核生物体内 存在某种转录因子。但直到80年代中期，研究人员发现DNA上转录因子的特异结合位点—热休克元件（Heat shock element,HSE）^［5］后，方才利用足迹法（Footprinting assay）和亲和层析法（HSE-affinity chromatography)找到并纯化了热休克转录因子（Heat shock transcription factor,HSF）^［6］。HSF本质上是一种蛋白质，其结构和功能在进化中较少变异，因此具有广泛的同源性，在真菌、果蝇、鸡、人类等真核生物中都有存在。

2HSF的 类别与功能

从HSF发现到现在，随研究的深入及新技术的采用，在不同生物体内，发现了越来越多的HSF及其基因，如：人体内有hHSF1、2、4^［7］；鸡体内有cHSF1、2、3；小鼠体内有mHSF1、2；西红柿有3种HSF；只有一种HSF的生物也很 多。

HSF在热应激反应中的主要功能，是在热休克基因的表达过程中与相应启动子结合，启动基因的转录过程，最终促进HSP的表达（详见后述）。但在高等真核生物体内，如脊椎动物及哺乳动物，不同种类的HSF，虽然结构上很相似，但功能上却出现了不同程度的差异。其中，只有HSF1是最有代表性、最具有完全意 义的HSF，而其它HSF则不然。如HSF2，有研究证明HSF2对热刺激信号耐受；通常认为它对代表生长、发育、分化的信号更为敏感，其组织含量及活性变化的时相也证实了这一点^［8］。如cHSF3，虽然也对热刺激信号起反应，但其活化阈值却高于cHSF1，在较高温度时仍能保持活性。而最新发现的hHSF4^［7］似乎是一个通过减少 hSE结合位点，而专门起抑制作用的HSF，其生物学意义在于控制热应激反应的动态平衡。

3HSF的结构

虽然从不同生物体内分离出来的HSF分子种类和大小各有不同，如从酵母菌、果蝇、人类体内分离出来 的HSF，其分子量分别为：150、110、80×103u；但其结构却极为相似，共同具有一个极为保守的核心区域—— DNA结合区域（DNAbindingdomain）和三聚区域（Trimerizationdomain）。

3.1DNA结合区域（DNAbindingdomain）

DNA结合区域靠HSF的N－末端，位于HSF最保守的区域中，其晶体结构与溶解状态的结构比较一致，都具有 DNA结合蛋白特征性的螺旋－转角－螺旋结构基元（ helix－turn－helixmotif），由3个螺旋（H1、H2和H3）和4个反向平行的β－片层（β－sheet）（β1、β2、β3和β4）组成，其排列顺序如下：

DNA结合区域通过螺旋－转角－螺旋结构形成了一个紧密的球形结构。但与其它DNA结合蛋白（如CAP）的DNA结合区域不同的是：HSF的DNA结合区域有一个α－螺旋凸起（α－helical bulge）；一个由脯氨酸诱导的扭结（Proline－induced kink），该扭结使H2发生明显扭曲；在H2和H3之间有一段5～7个氨基酸的间隔。对于非植物性来源的HSF，在β3和β4之间还有一个暴露的、易曲的可溶性环状结构。

HSF的DNA结合区域与DNA结合的部位起始于H1的N端后数个氨基酸处。终止位置对不同的HSF并不一致，但多数认为终止位置位于β4末端之后的16个氨基酸处。这16个氨基酸的功能一方面是通过与疏水核心的相互作用在空间结构上封闭DNA结构区域的一个侧面；另一方面 是使HSF三聚体中各HSF单体的DNA结合区域相互协调，以获得对热休克元件（HSE）的高亲和力。

DNA通过主沟与HSF结合，具体结合位点就是DNA上的 HSE。HSF能识别HSE上特异性的“－nGAAn－”结构，HSF单体与“－nGAAn－”结构以1:1的比例结合。HSE上“－nGAAn－ ”结构的数目对HSF与HSE亲和性有很大的影响。一个完整的HSE结构上通常有3个“－nGAAn－”结构，而完整的 HSF也是以三聚体的形式与HSE结合，这样的结合具有最大的亲和力。若HSE上只有2个“－nGAAn－”结构，两者的亲和力只能达到中等水平。

许多物理学与遗传学证据都表明，DNA结合区域螺旋－转角－螺旋结构上的第3个螺旋（H3）起识别HSE上 “－nGAAn－”结构的作用。H3通过其极性及阳性氨基酸残基在溶液中形成一个典型的双岐性螺旋（Amphipathic helix），与DNA通过离子键相互作用，但具体的机制尚不清楚。

3.2三聚区域

当HSF活化时，相互间需通过三聚区域结合形成HSF三聚体。相对于DNA结合区域，三聚区域位于HSF的C－末端。三聚区域的特征性结构是3个疏水七氨基酸重复序 列（Hydrophobic heptad repeat array）。这3个序列由数目不等的 七氨基酸重复（Heptad repeat）构成。第一个序列较长， 有5～6个七氨基酸重复；第二和第三个序列较短，且基本上重叠在一起，前后只差一个氨基酸；第一个序列与后两个序列之间由QQQ基元（QQQmotif）隔开。（ 注：Q即谷氨酰胺残基）

每个七氨基酸重复的第一和第四个疏水氨基酸残基是螺旋型卷曲螺旋结构（Helical coiled-coil structure）所特有的，可用于形成亮氨酸拉链（Leucine zipper）^［9］。但具有亮氨酸拉链的蛋白通常形成同二聚体或异二 聚体，像HSF这样形成三聚体的非常少见。

以流体力学方法检测HSF三聚体所得结果表明，三聚体的空间结构比预期的紧密，因此，HSF三聚区域的空间结构并非如所想像的是一个简单的连续卷曲 螺旋（Coiled-coil），其构型可能与流感病毒血凝素的三聚区域相似：较长的七氨基酸重复序列内部相互作用，形成一个三链α-螺旋型卷曲螺旋（Triple-stranded α-helical coiled-coil），其外部由较短的七氨基酸 重复序列形成一个α-螺旋，以稳定其结构。

3.3其它结构

3.3.1活化区域（Activator domain）除DNA结合区域与三聚区域外，促进热休克基因转录的活化区域也是HSF较重要的结构之一，但活化区域与上述两个结构区域不同，其物种间的同源性不高，位置也不很确定。通过遗传学方法可将KLHSF（Kluyveromyces lactis HSF）的C末端活化子 （Carboxy-terminal activator,CTA）定位于C末端的32个氨基酸残 基内；而ScHSF（Saccharomyces cerevisiaeHSF）的CTA则散在于180个氨 基酸残基内。N－末端活化子（N－termina lactivator,NTA）的 位置尚未确定。

高等真核生物的情况就比较复杂，其活化区域的确定就相对困难一些，可能位于C-末端的某些区域。 如hHSF1有2个独立的活化区域，位于靠C-端1/3处，受所谓中心调节区域（Central regulatory domain）的调节。该调节区域位于三聚区域与该活化区域之间，对热刺激信 号敏感［^10］。

3.1.2CE2CE2是位于HSFC-末端的一小段序列，也是HSF最为保守的序列之一，能够抑制HSF的转录促进功能。但 CE2仅见于酵母菌，高等生物缺乏这一结构。

4HSF活化过程

多种内、外界刺激因素均可活化HSF，其中以热休克为最典型、最传统的活化方式。细胞受到高温刺激后，通过目前尚不完全了解的机制，促进HSF活化，HSF从无活性到有活性的这一活化过程现在知道得较为清楚，简述如下：

4.1形成HSF三聚体

无应激状态下，HSF以无活性的单体形式存在。当细胞处于应激状态时，细胞内环境发生变化，解除了 对HSF的活性抑制，促进HSF由单体向三聚体转换。HSF之间通过三聚区域结合，具体位点是三聚区域的3个七氨基酸重复序列。无应激时，这3个序列在HSF内部形成稳定的卷曲螺旋结构，以维持其单体状态；应激时，在不明机制作用下，卷曲螺旋结构打开，相邻 HS