第三军医大学学报2000年第22卷第1期

王培勇刘健曾强许蜀闽王俊元孙秉庸

摘要目的：缺氧能否通过影响血管平滑肌细胞血管活性肽的自分泌功能而参与缺氧性肺动脉高压的发生尚不明确，本实验在培养的新生小牛肺动脉平滑肌细胞(PASM)上探讨内皮素-1(ET-1)自分泌在其中的作用。方法：采用³H-TdR掺入研究PASM增殖，放免测定和斑点杂交技术研究ET-1的分泌和表达。结果：无氧培养(0％O₂)24h使新生小牛肺动脉平滑肌细胞(PASM)的³H-TdR掺入与常氧组相比增加42.3％(P＜0.001)，ETA受体拮抗剂BQ123(10^－6mmol/L)使常氧培养的PASM的³H-TdR掺入降低47％(P＜0.01)，但对缺氧培养条件下PASM的³H-TdR掺入无显著影响。采用放免测定发现，缺氧培养3～48h导致PASM的ET-1分泌降低非常显著(P＜0.01)。斑点杂交显示，缺氧同样抑制PASM的ET-1的mRNA表达(P＜0.01)。结论：ET-1参与常氧情况下PASM增殖的调节，而与缺氧引起的PASM过度增殖无关，缺氧可通过抑制PASM的ET-1mRNA的表达而抑制ET-1的合成和分泌。

关键词：缺氧；肺动脉平滑肌细胞；内皮素-1

急性和慢性缺氧均可导致肺动脉高压，肺血管床特别是肺小动脉平滑肌收缩和结构改建(Remodeling)是缺氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension,HPH)形成和维持的基础，其中血管壁平滑肌增殖为其主要特征。尽管对其机制进行了大量研究，但仍有许多环节尚不明确。目前已知，除了血管内皮细胞分泌血管活性成份以旁分泌的方式调节血管平滑肌的舒缩和增殖外，血管平滑肌细胞本身也能以自分泌的方式产生许多血管活性成份^［1］。研究表明，肺动脉内皮细胞通过旁分泌内皮素-1(Endothelin-1，ET-1)在HPH的发生中起重要作用，但缺氧能否通过影响平滑肌细胞自分泌ET-1而参与缺氧性肺血管收缩和结构改建尚未见报道。因此，本实验动态观察了缺氧对培养的小牛肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASM)ET-1自分泌的影响，并研究其变化的机制，以探讨平滑肌ET-1自分泌功能的改变在HPH发生中所起的作用。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂

胰蛋白酶(DIFICO，1∶250)，RPMI 1640(JR SCIENTI-FICINC.USA)，ETA受体拮抗剂BQ123和ET-1 cDNA及ET-1单克隆抗体(Penisula Lab,USA),ET-1测定试剂盒(北方免疫试剂研究所)，抑肽酶和地高辛配基标记与检测试剂盒(德国BoehringerMannheim)，无氧混合气(N₂中含5％CO₂，重庆气体制造厂)，³H-标记胸腺嘧啶核苷(中国原子能科学研究所)，S-P免疫组化染色试剂盒(福建迈新生物技术开发公司)，其它试剂均为国产或进口AR级。所用的培养器皿为COSTAR产品。

1.2细胞培养

取新生小牛活杀后用5％CO₂孵箱培养PASM^［2］，培养成功后采用3～10代细胞进行试验。采用台盼蓝染色法鉴定细胞活力。取对数生长期的PASM，以10⁴/cm²的密度传代接种于培养瓶后加入含20％小牛血清的RPMI1640培养2～3d，待细胞汇合成单层后换为含1％透析和灭活的贫血小板小牛血清的培养基，分组进行下述实验。

1.3³H-TdR掺入的增殖分析

PASM按每孔2万细胞接种于96孔培养板，长成单层后换含1％经透析和灭活的贫血小板血清RPMI1640培养基，将细胞分为下述各组：常氧组、缺氧组、常氧＋BQ123组和缺氧＋BQ123组。常氧组置21％O₂的CO₂孵箱培养；缺氧组置于缺氧培养箱内，通入无氧混合气，平衡后测定的氧浓度约为0.034％(0～0.7％，下同)。培养24h，最后6h加入³H-TdR(0.5μCi/孔)，收集细胞后用β-液体闪烁计仪(RackβLKB-1217，芬兰)测Bq。

1.4ET-1的免疫组化染色

将PASM接种于24孔培养板内的玻片上，生长成层后换含1％经透析和灭活的贫血小板血清RPMI1640培养基，分常氧和无氧组，n=5。培养24h后，将细胞用4％多聚甲醛固定，应用S-P法进行ET-1免疫组化染色，以棕黄色为阳性。用真彩色医学图像分析系统(空军总医院CMIAS007)测其积分光密度(IOD)值，作为细胞内ET-1的相对含量。

1.5ET-1放免测定和ET-1mRNA斑点杂交

PASM按10⁴/cm²细胞密度接种于3025培养瓶，培养方法同上。将细胞分为常氧组和缺氧组，缺氧方法同上。上述每组又分为1.5、3、6、12、24和48h等6个不同的时相点，以动态观察ET-1的分泌和表达变化。根据上述分组，取培养上清液按药盒说明书测定ET-1含量，将细胞用0.1％胰蛋白酶消化收集，用冷的PBS液(pH7.2)冲洗，离心后速冷于－196℃的液氮中保存备用。

1.5.1PASM总RNA的提取将液氮中冻存的PASM取出复融，按酚-氯仿-异硫氰酸胍法^［3］略加改进提取RNA。所提的RNA溶于0.1％DEPC处理水中，应用UV-240多功能紫外分光光度仪(日本津岛)三复管测定各例总RNA的260nm、280nmD值和二者比值，结果D_260/280比值均在1.8以上，RNA置－70℃冷冻备用。

1.5.2ET-1cDNA探针标记及斑点印迹杂交将1.3kb人ET-1cDNA煮沸变性后，按照地高辛配基标记与检测试剂盒说明书，用地高辛配基随机引物法标记探针，并冷置备用。从每组PASM的RNA中分别取20μg，用样品稀释液(20×SSC∶37％甲醛=1∶1)稀释至10μl，65℃水浴15min使RNA充分变性后点于硝酸纤维素膜上，80℃真空烤膜2h。烤好的NC膜放入20ml预杂交液［50％甲酰胺、5×Denhardt、6×SSPE、0.1％十二烷酰肌氨酸纳(Sarcoayl)、0.02％SDS］中42℃震荡预杂交6h，将膜取出置入杂交液中(预杂交液成分加地高辛配基标记cDNA探针25ng/ml及经超声打碎热变性的鲑鱼精DNA100μg/ml)42℃杂交24～36h。杂交后的NC膜按地高辛配基标记与检测试剂盒说明进行洗膜、10×Denhardt封阻，之后与抗地高辛抗体(1∶5000)于37℃反应30min，再漂洗去多余抗体后进行显色。终止显色，湿膜用薄层色谱扫描仪(CS-910日本岛津)和图像分析仪(C-RIB日本岛津)进行光密度扫描和分析，测定积分光密度代表mRNA相对含量。所得数据以相对于常氧的百分比(100％)表示，求3次试验的均值。

1.6统计学分析

所得数据采用多因素(SuperANOVA)方差分析，结果以表示，做方差保护下的最小差值显著性检验。

2结果

2.1ET-1免疫组化染色

缺氧6～48h后，相差显微镜下观察PASM的形态无显著变化，台盼蓝染色表明细胞活力均大于95％。21％O₂组PASM的ET-1染色可见密集的阳性反应颗粒，呈黄褐色，与0％O₂组PASM胞浆内ET-1染色阳性反应相似。两组呈阳性反应的细胞数占该组细胞总数的90％以上。图像分析结果表明常氧24h细胞ET-1免疫组化染色积分光密度值(IOD)与无氧组差异不显著(积分光密度值分别为3747.23±1352.9和3854.21±958.38，P＞0.05)。见图1。

图1培养的肺动脉平滑肌细胞ET-1免疫组织化学染色(S-P×250)A：21％O₂＋5％CO₂；B:0％O₂＋5％CO₂

fig1Endothelin-1 immunohistochemistry staining in pulmonary arterial smooth muscle cells cultured in normoxic (A) and hypoxic (B) conditions(S-P×250)

2.2缺氧对PASM细胞ET-1自分泌的影响

培养的PASM细胞的ET-1分泌速度于3～6h达高峰，12h后随培养时间的延长而逐渐降低。缺氧情况下，ET-1分泌显著减少，其减少的程度与孵育时间有关，缺氧3～6hET-1分泌约降低58％～66％(P＜0.001)；缺氧12～48hET-1分泌约降低15％～33％(P＜0.01)。见图2。

图2缺氧对PASM自分泌ET-1的影响(n=3)

fig2Effect of hypoxia on ET-1 autocrine by PASM(n=3)

＊:P＜0.01,＊＊：P＜0.001 vs 21％O₂

2.3缺氧对PASM的ET-1mRNA表达的影响

斑点杂交显示，缺氧使PASM的ET-1的mRNA表达显著受抑制(P＜0.01)。见图3。

图3缺氧对PASM的ET-1mRNA表达的影响(n=3)

fig3Effect of hypoxia on ET-1 mRNA expression in PASM(n=3)＊：P＜0.01 vs 21％O₂

2.4ETA受体拮抗剂BQ123对PASM增殖的影响

常氧培养的PASM于培养基中加入10^－3mmol/L的BQ123培养24h，其³H-TdR掺入显著减少，约减少47<