第二军医大学学报2000年第21卷第6期

卢洋黎怀星李建秀傅继梁

摘要目的：建立在基因组中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系，为体内基因突变研究提供有效的动物模型。方法：利用分子克隆技术构建pMTR1质粒。将其线性化后，用显微注射法注射入572只C57BL/6小鼠受精卵，再将它们分别移入45只受体母鼠的输卵管中，共产仔44只，存活35只，采用PCR，PCR-Southern和基因组Southern杂交三级筛选法鉴定子代小鼠。以4只经基因组Southern杂交证实在基因组DNA中整合有多拷贝结构完整的pMTR1质粒的小鼠作Founder小鼠，进行转基因小鼠的建系工作。对每个Founder小鼠已有的F1代及F2代转基因小鼠的基因组DNA进行pMTR1质粒回收实验。结果：从转基因小鼠基因组中可以回收出结构、功能完整的pMTR1质粒。结论：（1）建立了在基因组DNA中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系；（2）该转基因小鼠能用作哺乳动物体内突变研究模型。

关键词：转基因小鼠；诱变；lacⅠ基因；质粒

转基因小鼠突变研究模型是检测哺乳动物体内组织特异性基因突变的一个快速、有效的系统。目前注册商标为BigBlue^TM，Muta^TMMouse和Xenomouse的一些小鼠模型已经进入商业销售渠道^［1～3］。其中前两种模型因采用λ噬菌体为载体，在载体回收时受到体外包装分子大小的限制，对基因组片段大小依赖性较大；而后者虽以质粒为载体克服了这些缺点，但它是以较长的lac z基因（3 087 bp）作突变靶基因，因而在进行突变子的序列分析时，工作量较大，而且从蓝色的野生型菌落中选择白色或无色的突变型菌落，易产生实验误差，从而增加了工作难度。黎怀星等在国内率先建立了以pSPORT1质粒为载体和以lacⅠ基因为诱变靶基因的转基因小鼠（D6-2）突变模型^［4～6］，但该小鼠模型的遗传背景是我国的昆明种小白鼠，而目前所报道的大多数哺乳动物体内的突变研究数据都来源于C57BL/6小鼠体内。为了增加数据的可比性，本研究建立了几个以pMTR1质粒为载体的C57BL/6转基因小鼠家系，它们除了具有D6-2小鼠的优点^［5,6］外，还因pMTR1质粒具有incA不相容性位点而可以增加质粒产量，提高载体回收效率；此外，该转基因小鼠的遗传背景是C57BL/6，因而更有利于突变数据的比较分析。

1材料和方法

1.1主要材料C57BL/6小鼠由第二军医大学实验动物中心提供。pSPORT1和pSPORT2质粒以及DH10B宿主菌均购自Gibco bRL公司。标记探针的试剂盒（rediprime DNA labeling system）购自Amersham公司；lacⅠ基因的特异性PCR引物由Sangon生物工程公司合成，其序列为：P1:5′-AGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGG-3′，P2: 5′-CTTTC-GCGGTATGGCATGATAGCGC-3′，能扩增出468 bp长的DNA片段；QIAquick Gel Extract Kit购自QIAgene公司；其他酶等试剂主要来源于Promega公司和Gibco bRL公司；α-³²P-dCTP核素购自北京亚辉生物技术公司。

1.2pMTR1载体的构建和鉴定将pSPORT2和pSPORT1质粒DNA同时用EcoRⅠ+ sca Ⅰ酶切，然后分别回收来源于pSPORT2的1.3 kb DNA片段和来源于pSPORT1的2.9 kb载体片段，并用T4 DNA连接酶进行连接重组。对获得的质粒DNA进行酶切鉴定和乳糖操纵子功能鉴定，然后将结构和功能正确的重组质粒命名为pMTR1，以RcaⅠ酶切线性化，用QIAquick Gel Extract Kit 回收、纯化4.2 kb片段，并溶于适量缓冲液中（5 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，0.2 mmol/L EDTA）至浓度为1～2 μg/ml，以备显微注射用。

1.3转基因小鼠的制备实验用供体和受体母鼠的制备，受精卵的采集，显微注射和移植均按Hogan等^［7］的方法进行。

1.4仔鼠的鉴定采用PCR, PCR-Southern杂交和基因组DNA的Southern杂交三级筛选法鉴定。

1.4.1小鼠基因组DNA制备取2周龄幼鼠的1.5 cm尾尖用蛋白酶K法^［8］提取基因组DNA。

1.4.2PCR分析PCR循环条件94℃ 30 s，65℃ 45 s，72℃ 1 min共进行30个循环。采用质粒DNA和普通小鼠基因组DNA分别作阳性和阴性对照。扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。

1.4.3Southern杂交分析将20 μg经96 U EcoR Ⅰ酶完全酶切后的小鼠基因组DNA或PCR产物按常规方法进行电泳和转膜^［8］后，于68℃杂交液(7% sDS, 0.5 mol/L NaH₂PO₄, 0.5 mol/L Na₂HPO₄,10 mmol/L EDTA, 1% BSA)中预杂交6 h，然后加入探针(取25 ng线性化的pMTR1 dNA作模板，采用Rediprime DNA Labeling System制备α-³²P-dCTP核素标记的探针)，继续杂交16 h，将pMTR1质粒DNA和普通小鼠基因组DNA或其PCR产物分别用作阳性和阴性对照。用洗膜液A(0.5% bSA, 5% SDS, 1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Na₂HPO₄, 40 mmol/L naH₂PO₄)于室温洗膜2次共30 min，再用洗膜液 b(1% SDS, 1 mmol/L EDTA, 40 mmol/L Na₂HPO₄, 40 mmol/L NaH₂ pO₄)于68℃ 30 min洗1次，最后用0.1×SSC漂洗,按常规进行压片和放射自显影。

1.5从转基因小鼠的基因组DNA中回收pMTR1载体取10 μg 经EcoRⅠ完全酶切的小鼠基因组DNA，75℃处理10 min，用双蒸水稀释至449 μl，加入50 μl 10×Buffer，1 μl(3U)T4 DNA连接酶，于16℃连接12 h。取5 μl连接环化的DNA液转化DH10B感受态细胞，涂布含X-gal的 amp^r LB琼脂平板，37℃孵育16～24 h。计数转化平板上的菌落数，确定回收效率，并随机挑取单菌落进行酶切鉴定，同时观察有无突变子（平板上的蓝色克隆）出现。

2结果和讨论

本研究共对572只C57BL/6小鼠受精卵注射了线性化pMTR1质粒DNA，将注射后的受精卵分别移植入45只受体母鼠的输卵管中，共产仔44只，其中35只存活。经PCR和PCR-Southern杂交检测，有11只小鼠(M₀-1～M₀-11)呈阳性(图1)。为了证实pMTR1质粒在小鼠基因组中的结构完整性，对这11只小鼠基因组DNA进一步作Southern杂交，结果仅4只(M₀-1, m₀-2, M₀-3, M₀-4)为阳性（图2）。我们认为导致这种差异的主要原因有两方面：一是PCR结果可能有假阳性；二是基因组DNA的Southern杂交不如PCR灵敏，使得部分阳性小鼠在鉴定时呈阴性。从基因的整合效率来看，本研究中线性化的pMTR1质粒的整合率为11.4%（4/35），与文献报道的10%～20%相当^［7,9］。

图 1部分转基因小鼠PCR-Southern杂交结果

fig 1PCR-Southern blotting results of partial transgenic mice

1: pMTR1; 2: H₂O; 3: Normal C57BL/6; 4a: M₀-16; 5a～17a: m₀-1～ M₀-13;4b, 5b: M₁₁-9, M₁₁-10;

6b～9b: M₁₁-1～ M₁₁-4; 10b: M₁₁-11; 11b,12b: m₁₁-21, M₁₁-22(M₁₁-n: F1 generation of M₀-1)

图 2部分转基因小鼠基因组DNA的 southern杂交结果

fig 2Genomic Southern blotting results of partial transgenic mice

1: pMTR1; 2: Normal C57BL/6; 3a～5a: M₁₂-8～M₁₂-10(M₁₂-n: f2 generation of M₀-1); 6a: M₁₂-4; 7a: M₁₂-6;8a～10a: m₁₂-12～M₁₂-14; 3b: M₀-4; 4b: M₀-3;5b: M₀-2; 6b, 7b: M₁₁-21, M₁₁-22; 8b: M₁₁-10;9b: M₁₁-19;3c～6c: M₃₁-1～M₃₁-4(M₃₁-n: f1 generation of M₀-3); 3d: M₀-5; 4d: M₀-10;5d: M₀-1; 3e～5e: M₂₁-1～ M₂₁-3(M₂₁-n: f1 generation of M₀-2)

将经过基因组DNA Southern杂交鉴定是阳性的这4只小鼠用作Founder小鼠，进行转基因小鼠的建系工作。目前除了M₀-4 founder小鼠尚无子代外，其余3只 Founder小鼠均已获得了F1子代小鼠，其中M₀-1 founder小鼠已有F2子代小鼠。对所有这些子代小鼠以PCR，PCR-Southern杂交和基因组DNA southern杂交进行检测 (图1和图2是部分小鼠的检测结果），结果表明：M₀-1 founder小鼠的22只子一代小鼠中有5只为阳性(M₁₁-3, M₁₁-10, m₁₁-19, M₁₁-21, M₁₁-22)，转基因遗传率为22.7%（5/22）；在33只子二代小鼠中有8只为阳性(M₁₂-4, m₁₂-6, M₁₂-8～M₁₂-10, M₁₂-12～M₁₂-14