第二军医大学学报2000年第21卷第3期

张平武邹蓓艳王慧丽孙树汉

关键词：基因小库；基因克隆

在基因克隆的方法选择中，构建基因组文库并筛选是克隆完整基因的经典方法,但构建基因组文库技术复杂，步骤繁琐。若构建的文库不够大，常筛选不到所需的目的基因。因此我们尝试用另一种方法，即在试探性的Southern blot基础上构建基因小库，从中筛选目的基因,可以大大减少筛库的工作量并提高筛到目的基因的成功率。现以克隆酵母Candida kefyr 的菊粉酶全基因为例将这两种方法加以比较。

1方法与结果

1.1菌株、质粒酵母Candida kefyr菌和质粒 pUC118 及pSK1为本室保存的菌株和质粒。大肠杆菌完全培养液LB：1% polypepton, 1% NaCl, 0.5% yeast extract（pH 7.0）。酵母菌完全培养液YEPD:1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% glucose。

1.2提取Candida kefyr基因组DNA参考文献［1］并做部分修改。

1.3基因组文库构建

1.3.1建立总DNA不完全酶切的条件取酵母基因组总DNA 10 μg，加入10×缓冲液15μl、无菌水至总体积为150 μl。分装于9个微离心管，使第9管含30μl，第2～8管各含15 μl。取Sau 3A Ⅰ酶4 U加入第9管,混匀后吸出15μl，加入第8管, 依次直至第2管，第1管中不加酶作为对照。全部9管置37℃水浴1 h后电泳分析，以主要降解片段集中在10 kb左右的酶浓度为最适，见图1。

1.3.2放大量部分酶切按最适条件放大，酶切总DNA 200 μg，实际操作时酶浓度减少1个梯度以免酶切过度。

1.3.3蔗糖密度梯度离心回收10 kb DNA片段在梯度形成仪制成10%～40%的连续蔗糖梯度，收集在4个38 ml离心管内。每管顶层加入1.2 ml待分离放大酶切DNA样品。超高速（2.6×10⁴ r/min）离心24 h。插入硅胶管以1 ml/min汲取梯度分离组分，每管收0.5 ml,按顺序编号。电泳检查分离效果(图2)，说明部分酶切的DNA样品已得到较好分离。

图1总DNA的部分酶切

1～9：不同酶量消化结果；10:λDNA/HindⅢ相对分子质量标准

1.3.4样品透析去蔗糖参考文献［2］，收集的DNA样品按4～8 kb,8～13 kb,13～18 kb分别合并成3组，装入3个透析袋中对2 000 ml tE(pH 8.0) 透析24 h，期间更换数次TE。透析后DNA样品用正丁醇浓缩至体积为5 ml，等体积乙醚抽提2次，无水乙醇沉淀，溶于TE(pH 8.0)备用。

图2蔗糖密度梯度分离的不同DNA片段

1～6及8～14: 梯度分离的不同DNA片段；

7: λDNA/Hind Ⅲ 相对分子质量标准

1.3.5载体处理pSK1 DNA用BamH Ⅰ酶切并去磷。

1.3.6连接与转化收集的外源片段DNA与载体按4∶1的摩尔比连接。连接产物转化DH5α菌，获得12670个菌落，构成基因组文库，经检验重组菌落的比率为84%。

1.4基因小库构建

1.4.1酶切总DNA和 Southern blot选用不同酶酶切总DNA，接近完全酶切。核素标记合成的寡核苷酸作探针，做不同酶酶切总DNA的Southern blot。我们发现BamH Ⅰ酶切效果较好，在9 kb处有单一杂交带，见图3。

图3总DNA的Southern blot分析

1:总DNA BamH Ⅰ酶切；2: λDNA/Hind Ⅲ相对分子质量标准；3,4: Southern blot

1.4.2合适片段回收以BamH Ⅰ 大量酶切总DNA，按标尺收集对应于杂交带同样大小的DNA片段（约9 kb）。

1.4.3载体处理pUC118 DNA用BamH Ⅰ 酶切并去磷。

1.4.4连接与转化收集的外源片段DNA与载体按4∶1的摩尔比连接。连接产物转化DH5α菌，获得3260个克隆，构成基因小库。

1.5两种文库中含目的基因克隆的筛选以核素标记合成的寡核苷酸作探针，采用菌落原位杂交的方法，从基因组文库中筛到含完整目的基因的克隆A37。经鉴定，该克隆含1.7 kb编码区、3.2 kb上游序列和1.7 kb的下游序列。从基因小库中筛到含完整目的基因的克隆4个(图4)。经鉴定，他们为相同克隆，均含1.7 kb编码区、4.3 kb上游序列和2.5 kb的下游序列。

图4原位杂交获得阳性克隆克隆1～4: 来自基因小库的阳性克隆；克隆B: 阴性对照；克隆A: 来自基因组文库的阳性克隆

2讨论

理论上构建基因组文库并筛选的方法用以克隆基因有通用性强、成功率高的优点，但实际构建基因组文库过程复杂，费时且技术难度较大。在DNA不全酶切、蔗糖梯度回收、离心后的分段收集的过程中都需十分小心，而且需要超高速离心机、蔗糖梯度形成仪等特殊仪器。

按公式N=ln(1-P)/ln(1-f)计算，要获得99%的概率检出基因组文库存在的10 kb片段，需重组克隆数6 905个。在大片段（超过8 kb）的连接和转化过程中不易获得足够的克隆数,从而影响克隆目的基因的成功率。

相反，基因小库构建技术难度小，过程相对简单，原位杂交筛选的工作量小，成功率高。关键性步骤在于Southern blot的结果，一旦找到某个酶能够产生单一Southern blot带，回收相应分子质量条带做连接转化就比较容易。由于针对性强，缩小了包围圈，筛到目的基因所需要的克隆数大大减少。

如果只需要克隆某一个特定基因，构建基因小库是快速有效的办法，但是克隆几个基因时需要重复做，而构建基因组文库一次则可克隆多个基因，因此，两者各有利弊，实际操作中可按需取舍。■

基金项目：国家自然科学基金资助项目（39670659）

作者简介:张平武（1965-）,男（汉族）,博士,讲师

张平武（第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海200433)

王慧丽（第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海200433)

孙树汉（第二军医大学基础医学部医学遗传学教研室,上海200433)

邹蓓艳（复旦大学业遗传所）

参考文献

［1］Harald r, Gotthard K. Cloning and characterization of a TEF gene for elongation factor1α from the yeast Arxula adeninivorans［J］. Current Genetics,1995,28:360-366.

［2］霍克克, 唐南筠, 虞兰兰, 等. 脆壁克鲁维酵母LAC4基因的克隆与表达［J］.中国科学B辑, 1995,25(5):149-153.