第三军医大学学报2000年第22卷第1期

何斌金锡御杨唐俊金欢胜王祥卫刘素英曾毅

摘要目的：探讨核酶对膀胱癌多药耐药性的逆转效应。方法：设计针对mdr1mRNA1959位GUC的“锤头状”（Hammerhead）核酶（Ribozyme1，RZ1）基因，定点克隆于逆转录病毒载体pLXSN的BamHI和EcoRI位点上，重组出带有核酶基因的逆转录病毒质粒pLXSN-RZ1。应用脂质体DoTap将pLXSN-RZ1导入到耐药的人膀胱癌细胞系BHA-60细胞中。结果：导入pLXSN-RZ1的细胞系耐药性显著降低，RT-PCR结果显示，细胞内mdr1mRNA显著减少。结论：本研究中设计的核酶能明显逆转膀胱癌细胞系多药耐药性。

关键词：核酶；多药耐药；肿瘤

肿瘤细胞的多药耐药性（Multidrug resistance，MDR）是影响肿瘤化疗效果的重要因素，我们曾应用体外转录mdr1 mRNA的方法证明核酶能切割mdr1 mRNA^［1］，但是，由于细胞内mdr1 mRNA较体外转录的mdr1 mRNA长，结构也复杂得多，尚不能肯定所设计的核酶也能在细胞内切割mdr1 mRNA，所以，我们将带有核酶（RZ1）基因的重组逆转录病毒质粒导入到耐药的人膀胱癌细胞系BHA-60细胞中，检测所设计的核酶能否在细胞内切割mdr1 mRNA，观察它们对MDR的逆转效应。

1材料和方法

1.1细胞模型的建立

1.1.1BIU-87人膀胱癌移行上皮细胞系，引自北京医科大学泌尿外科研究所^［2］。该细胞取材前及建株过程未接触任何抗癌药物。

1.1.2BHA-60细胞为本实验室应用转基因方法建立的多药耐药细胞系^［3］。

1.2主要试剂

质粒pLXSN：美国Miller教授惠赠，为逆转录病毒载体，在其多克隆位点上游含5’-LTR，在其多克隆位点下游含SV-40启动子和Neo基因。脂质体（DoTap）、TriPure^tmRNA提取试剂盒购自德国Boehringer mannheim公司。G418：美国Gibercol BRL公司产品，用20mmol/L的HEPES稀释成100μg/ml，0.2μm过滤器过滤除菌，分装后保存于－20℃备用。

1.3方法

1.3.1细胞培养细胞置于37℃，饱和湿度，含5％CO₂的孵箱中培养，培养液为含有10％新生小牛血清的RPMI1640。

1.3.2核酶逆转录病毒载体的构建根据计算机模拟mdr1mRNA二级结构，设计并合成核酶基因。质粒pLXSN经BamHI和EcoRI双酶切，在T4DNA连接酶作用下完成连接反应，导入JM109大肠杆菌，筛选出重组克隆。

1.3.3重组逆转录病毒质粒pLXSN-RZ1对耐药细胞BHA-60的转染按DoTap说明书操作。加入G418（终浓度为800μg/ml）选择培养，定期更换新鲜培养液，共选择培养14～16d，长出肉眼可见克隆。该细胞系命名为BHA-RZ1。

1.3.4细胞对药物（阿霉素ADM、秋水仙素COL）半数抑制量（IC₅₀）的测定按文献［4］报道用MTT法测定。

lgIC₅₀=∑(X_i＋X_i＋1)(P_i＋1－P_i)/2

i为组号，X_i＋X_i＋1为相邻两组对数剂量之和，P_i＋1－P_i为相邻两组抑制率之差。

1.3.5RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量按文献［5］进行。

1.4统计学处理

取5次试验的平均值，所有数据以表示，两个样本比较用t检验。

2结果

2.1重组逆转录病毒载体pLXSN-RZ1的酶切鉴定

RZ1基因与pLXSN载体连接混合物,常规CaCl₂方法导入大肠杆菌JM109，得到2个转化子，提取质粒。经BamHI和EcoRI各酶切6h，然后加入等体积的甲酰胺，55℃×5min，8％PAGE-8M尿素，电泳结果见图1。双酶切后的片段长度为48bp。该逆转录病毒载体命名为pLXSN-RZ1。

图1重组逆转录质粒pLXSN-RZ1的酶切分析(8％-PAGE)

fig1Restrictive digestion analysis of pLXSN-RZ1

1:pLXSN-RZ1＋BamH I＋EcoR I

2:pGEM-7Zf(＋)/Hae Ⅲ marker

2.2重组逆转录病毒质粒pLXSN-RZ1对BHA-60细胞的转染

加入DoTap及DNA混合液孵育后，未见细胞内出现异常颗粒或空泡化。加入G418后第2天即出现大量细胞死亡，第7天可见个别区域细胞呈岛状生长，细胞岛处细胞呈增生象，第11天散在的细胞几乎全部死亡（对照组细胞也全部死亡），细胞岛处细胞密度进一步增高。第14天时G418减少为600μg/ml，继续维持2d，然后G418减少为400μg/ml，维持1d后停用，说明pLXSN-RZ1已转染到BHA-60细胞内，该细胞命名为BHA-RZ1。

2.3细胞系多药耐药性的测定

2.3.1细胞对ADM的半数抑制量（IC₅₀）图2显示各细胞对ADM的IC₅₀值。BHA-RZ1与BHA-60细胞比较显著下降（P＜0.05），但高于BIU-87细胞的IC₅₀值。

图2细胞对ADM的IC₅₀值

fig2Value of cell IC₅₀ to ADM

2.3.2细胞对COL的半数抑制量（IC₅₀）图3显示各细胞对COL的IC₅₀值，BHA-60是BIU-87细胞的5.3倍（P＜0.01），BHA-RZ1较BHA-60细胞显著下降（P＜0.01）。

图3细胞对COL的IC₅₀值

fig3Value of cell IC₅₀ to COL

2.4RT-PCR检测细胞内mdr1mRNA表达

图4显示不同细胞在相同条件下RT-PCR的结果，β-actin作为内对照，在总RNA相同量的条件下β-actin的扩增条带基本相同（长度为587bp），mdr1157bp条带出现明显差异，以BHA-60细胞扩增条带最为明显，BHA-RZ1的扩增条带较BHA-60细胞弱。

图4不同细胞RT-PCR结果（2％琼脂糖凝胶）

fig4Agarose gel analysis of RT-PCR products for mdrl mRNA

1：pGEM-7zf(＋)/Hae Ⅱ marker

2：BIU-87 cells

3：BHA-60 cells

4：BHA-RZ1 cells

3讨论

MDR的发生机制较多，目前认为P-GP是形成MDR的最主要机制。因此，有关MDR的逆转研究也主要集中于对这一机制上。最早人们试图用药物来逆转MDR，Tsuruo^［6］用非细胞抑制剂量的异博定（Verapemil，VPL）能明显降低肿瘤细胞对长春新碱（Vincristine，VCR）的耐药性。尽管很多药物都有不同程度的逆转MDR作用，但是这些药物均只是在较高浓度条件下才能发挥作用，由于毒副作用，临床上不可能达到如此高的血药浓度，使应用药物逆转MDR受到限制。随着P-GP机制的进一步明确以及mdr1基因的成功克隆，使得用转基因方法逆转MDR成为可能。Elsa等^［7］报道，化疗药物Rhadamine123（R-123）在正常人肾系膜细胞（Human mersangial cell，HMC）中的半衰期为(25±3)s，将人工合成的mdr1mRNA反义寡核苷酸（aODN）20μg/ml与HMC共同孵育3d，R-123在HMC中的半衰期延长达(304±53)s，aODN显著地减少了P-GP在细胞膜上的表达量。

近年来，核酶用于基因治疗已取得很大进展，特别是在AIDS研究中的成果更是让人们对基因治疗的前景充满信心。核酶用于MDR的逆转研究近年来才有报道。Kobayashi^［8］合成两个核酶基因，分别切割mdr1 mRNA 196位和179位密码子，将切割mdr1 mRNA 196位密码子的核酶构建于pHβAPr-1 neo载体上，电穿孔法导入到耐药的人急性淋巴母细胞白血病细胞系(Human acute lymphoblastic leukemia cell line)MOLT-3/TMQ800中，转染核酶后MOLT-3/TMQ800对VCR的耐药性由原来的700倍（与其母细胞MOLT-3比较）下降至20～30倍。我们应用体外转录mdr1 mRNA等方法也证明，在无细胞环境下，本实验室设计的针对mdr1 mRNA1959位GUC的RZ1对mdr1 mRNA的切割达90％^［1］。本研究进一步将RZ1基因构<