第三军医大学学报2000年第22卷第7期

朱波罗成基郭朝华程晓明邹仲敏周进明

摘要： 目的探讨辐射对培养小鼠骨髓基质细胞内核因子-κB(NF-κB)的影响。方法采用免疫组化法及凝胶电泳迁移率实验。结果免疫组化方法显示正常骨髓基质细胞核的周围表达低水平的NF-κB，8.0 gy ⁶⁰Co辐射损伤后1 h即见其表达较正常显著升高并出现明显的核移位，4 h达高峰，6 h有所回落，8 h恢复正常；凝胶电泳迁移率实验发现正常骨髓基质细胞内存在低水平活性NF-κB，8.0 gy ⁶⁰Co辐射损伤后1 h即见其活性明显升高，4 h达高峰，8 h恢复正常。结论8.0 Gy辐射损伤后培养骨髓基质细胞内NF-κB的表达升高并激活，这可能与骨髓微环境内基质细胞的抗辐射能力及造血功能的恢复有关。

关键词：辐射；骨髓造血微环境；NF-κB

辐射损伤常见于战时核爆炸及平时的核事故，也是恶性血液病、实体瘤患者接受放疗过程中不可避免的损伤。骨髓是辐射损伤的敏感靶器官之一，射线主要损伤骨髓内的造血细胞，同时对骨髓造血微环境也有一定程度的损伤^［1］。细胞核因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)是细胞中一个重要的转录因子，它调控的基因编码急性时相蛋白、细胞因子和细胞粘附分子等。如与造血相关的细胞因子IL-6、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、TNF-α等均受NF-κB编码调控^［2］。此外，最近的研究表明，NF-κB能够抑制由辐射诱导的细胞凋亡^［3］。本实验拟通过观察辐射损伤后培养的小鼠骨髓基质细胞内NF-κB活性的改变来探讨上述机制。

1材料与方法

1.1动物来源及分组正常健康昆明种小鼠购于本校实验动物中心，重量在18～22 g，雌雄不限。设置正常对照及损伤组，每组15只，共30只。

1.2骨髓基质细胞的分离及培养^［4］

各观察组小鼠颈椎脱臼后，置75%酒精浸泡消毒，无菌条件下取双侧股骨，剔除肌肉剪断股骨头，用RPMI1640培养液冲出股骨内骨髓，依次用7号针头和5号针头把细胞吹打成单细胞悬液，加入RPMI1640(10%小牛血清、10%马血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)内，37℃，5%CO₂培养，第21天收集细胞。用作免疫组化的细胞预先在24孔培养板内加入盖玻片。

1.3细胞辐照培养第21天细胞用本室钴源辐照，剂量率为1.07Gy/min总剂量为8.0Gy。

1.4免疫组织化学S-P染色^［5］在各时相点挑取玻片，用0.1molPBS漂洗3次，加4%多聚甲醛50μl固定40min,0.1molPBS漂洗3次，3%过氧化氢室温下10min,0.1molPBS漂洗3次，5%山羊血清37℃置30min，吸弃血清，加1∶100稀释的P65(Santacruz美国)37℃3h，4℃过夜，0.1molPBS漂洗3次，加生物素标记的二抗(Ig/Bio1∶20)(SP-Kit,北京中山公司)，37℃2h，0.1molPBS漂洗3次，加HRP/SP(1∶200)复合物37℃2h，0.1molPBS漂洗3次，DAB法显色5min，脱水、透明、DPX封片，免疫组化对照：用血清稀释液代替一抗，其余步骤同前。

1.5核蛋白的提取

核蛋白的提取按Zhou^［6］报道的方法加以改良，细胞经PBS洗涤后，悬浮在缓冲液A400 ml中(10 mmol/L Hepes,pH 7.9, 10 mmol/L KCl,0.1 mmol/L EDTA, 0.2% NP-40,1 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PBSF, 1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin)，混匀后冰置15 min，加入10%NP-40 25 μl，剧烈震荡15 s，13000×g、离心10 s，吸弃上清，加入50μl缓冲液C (20 mmol/L Hepes,pH 7.9, 420 mmol/L NaCl,0.1 mmol/L EDTA,1.5 mmol/L mgCl,25% Glycerol, 1 mmol/L DTT,0.1 mmol/L PMSF, 1 mg/L Leupeptin、antipain、aprotinin和pepstatin)中，冰置30 min，剧烈震荡15 s，4 ℃、12 500×g离心10 min，取上清，以考马斯量蓝法测定提取液蛋白浓度，并将其置于-70℃待用。

1.6凝胶电泳迁移率实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)

将5 μg核蛋白加入至15 μl的结合反应缓冲液中［HEPES、NaCl、EDTA、甘油、BSA和2.5μg/ml poly(dI/dC)］，冰上作用20 min。探针用具有与NF-κB转录因子结合位点的双链寡核苷酸，其序列为：5′-TCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG-3′。探针经末端标记法用γ³²P-ATP(Amershan)标记后，测放射性核素每分钟闪烁计数值。用TE稀释后取1μl探针加入反应液中与核蛋白孵育30 min，反应产物用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳恒压电泳3 h，真空加热干燥后，-70°C用X线射片放射自显影3 h，即与特异性DNA结合的NF-κB转录因子的复合物。相同实验重复3次。

1.7凝胶电泳迁移率竞争抑制实验

在凝胶电泳率实验中设两组竞争性对照，一组为特异性竞争抑制实验，即在反应体系中加入200倍未标记的特异性NF-κB探针，另一组为非特异性竞争抑制实验，即在反应体系中加入200倍非特异性的未标记探针，非特异性未标记探针为GATA3寡核苷酸探针，其序列为：5′-TGCTAACAATCAGATAGAGG-3′，5′-CCTCTATCTGATTGTTAGCA-3′；室温下置10min后加入标记探针。以后步骤同凝胶电泳迁移率实验。

2结果

2.1NF-κB免疫组化染色结果正常培养骨髓基质细胞NF-κB蛋白主要位于细胞浆内细胞核的周围，免疫组化阳性反应较弱。8.0Gy辐射后1～2h即见其表达升高并向核内转位。4h在核内明显聚集，6h表达开始下降，8h恢复至正常，见图1、2。

图1正常培养小鼠骨髓基质细胞NF-κB蛋白免疫组织化学(S-P×200)

仅见弱阳性的NF-κB存在于细胞浆内细胞核的周围

fig 1Expression of NF-κB assayed by SP-stained immunohistochemistry in normal murine bone marrow stromal cells(S-P×200)

weak positive of NF-κB protein exist in the cytoplasm

图2正常培养小鼠骨髓基质细胞经8.0 gy辐射后4 h

nF-κB蛋白免疫组织化学(S-P×200)

可见强阳性染色存在于细胞核内

fig 2Expression of NF-κB assayed by SP-stained immunohistochemistry in irradiated murine bone marrow stromal cells at 4 hours after radiation(S-P×200)

intensive positive of NF-κB protein exist in the nucleus

2.2凝胶电泳迁移率实验检测NF-κB活性结果

8.0Gy辐射后小鼠脾脏T细胞内NF-κB活性在1～2h即见明显高于正常对照，4h达到高峰，6h开始下降，8h恢复正常。100倍、200倍未标记的NF-κB寡核苷酸探针能阻断蛋白阻滞，200倍的GATA未标记探针对蛋白阻滞实验无显著影响，见图3、4。

图3凝胶电泳迁移率法检测正常和辐射后各时相点NF-κB活性结果条带1：正常对照；条带2～6：辐射后1、2、4、6、8 h

fig 3Activities of NF-κB detected by electrophoretic mobility shift assay in normal and irradiated cultured murine bone marrow stromal cells(BMSCs) in

lane 1:Normal BMSCs; Lane 2～6:1、2、4、6、8 h after exposure to radiation

图4凝胶电泳迁移率的特异性竞争抑制实验和非特异性竞争抑制实验条带1：辐射后4 h；条带2：辐射后4 h+100倍未标记的NF-κB寡核苷酸探针；条带3：辐射后4 h+200倍未标记的NF-κB寡核苷酸探针；条带4：辐射后4 h+200倍未标记的GATA-3寡核苷酸探针

fig 4Specific and non-specific competitive experimentLane 1: 4 h after radiation; Lane 2:100 times unlabeled NF-κB oligonucleotide+4 h after radiation;Lane 3:200 times unlabeled NF-κB oligonucleotide+4 h after radiation;Lane 4:200 times unlabeled GATA-3 oligonucleotide+4 h after radiation

3讨论

骨髓基质细胞是造血微环境的重要组成成分，也是骨髓体内外产生造血活性所必须的结构基础^［1］。它在骨髓中的作用主要有以下3方面：①为造血干细胞的生存提供不可缺少的物理支柱；②通过粘附分子作为桥梁与造血干、祖细胞形成“配体-整合蛋白-细胞骨架跨膜系统”，从而影响造血实质细胞的形态，调控基因表达，控制细胞的分化，决定细胞的运动；③通过<