第四军医大学学报2000年第21卷第2期

王琳惠延年王雨生惠宏襄金明

摘要: 目的观察反义增生细胞核抗原(PCNA)和反义bcl-2脱氧寡核苷酸对培养的人视网膜色素上皮细胞(RPE)生长的作用.方法用DNA合成仪合成有18个核苷酸的反义PCNA和15个核苷酸的反义bcl-2脱氧寡核苷酸片段，以不同浓度加入RPE培养液，培养2～4 d, 用SABC法检测细胞PCNA和bcl-2的表达，用MTT法及流式细胞仪测定细胞抑制率.结果6.25～100 μmol·L^-1的反义PCNA对RPE的抑制率为8.3%～38.4%,呈剂量依赖性，并抑制细胞PCNA的表达. 反义bcl-2未显示抑制作用.结论反义PCNA脱氧寡核苷酸可抑制近40%的RPE生长，其临床应用值得进一步研究.

关键词：色素上皮/眼；PCNA；bcl-2；反义脱氧寡核苷酸

0引言

对RPE生长的抑制已成为增生性玻璃体视网膜病变(PVR)辅助治疗和预防的重要措施.类固醇和抗代谢药的临床疗效尚未肯定^［1,2］.抑制所有细胞必须的过程如微管转运或RNA,DNA合成的药物都有潜在的毒性^［3］.而用生物疗法包括基因治疗可能从分子水平调控或抑制细胞生长.反义核酸技术是最具潜力的基因疗法之一，利用人工合成的寡核苷酸片段有选择地封闭某种基因，可抑制细胞增生，且少有细胞毒性^［4］.寡核苷酸(PCNA)是DNA复制的一种重要蛋白，在培养的人RPE中有较高的表达^［5］.反义PCNA可能抑制RPE增生. Bcl-2有抗凋亡作用，与细胞生长不无关系^［6］.为观察反义ODN对RPE的作用，进行了本实验.

1材料和方法

1.1材料人RPE的培养和鉴定同以往的报告^［7］.合成的反义PCNA的核苷酸序列为: 5′ TTCGAGGCGCGCCTGGTC 3′.该序列与PCNA基因mRNA的起始码及其后的5个三联码互补.采用亚磷酰胺DNA合成法，在固相硅胶上按 3′→5′方向合成，并进行硫代修饰.合成的反义bcl-2的核苷酸序列为: 5′CCCAGCGTGCGCCAT 3′.此序列与bcl-2基因mRNA的起始位点及其后的4个三联码互补.合成方法与合成反义PCNA片段相同，亦经硫代修饰.

1.2方法反义寡核苷酸对RPE的PCNA和bcl-2表达的影响,将6～10次传代的RPE悬液以1.5×10^7．L^-1的密度接种于置有18mm盖玻片的6孔培养板中，每孔2mL，同时加入100μmol^．L^-1的反义PCNA或反义bcl-2，于接种后48h取出细胞片，终止培养.用PBS浸洗细胞片，冰丙酮固定. 抗PCNA和抗bcl-2免疫细胞化学染色,采用SABC染色法^［5］. 染色结果的图像分析,采用真彩色图像分析仪，每张细胞片于高倍(×200)显微镜下随机选取30～35个阳性细胞进行测量分析，得出目标积分光密度，每组3张片，然后进行t检验.

MTT比色法测定反义PCNA对RPE增生的作用采用传代6～10次的细胞,调整至1×10^7．L^-1，接种至96孔培养板中，每孔0.2 mL，置于CO₂孵箱，孵育24 h后更换5 g^．L^-1 nBS的DMEM液，同时加入反义PCNA和无关序列的核苷酸片段，使其终浓度分别为6.25,12.5,25,50和100μmol^．L^-1，继续培养，每天换液1次，并加相应浓度的反义核酸，至48 h,3 d和4 d时，采用MTT法测定A值. 计算反义核酸对RPE生长的抑制率，并作统计学处理.每组平行6孔. 实验重复2次. 反义核酸片段对细胞周期的影响:将密度为1×10^7．L^-1的细胞接种于80 mL培养瓶，孵育24 h后更换50 mL^．L^-1NBS的DMEM培养液，同时分别加入反义PCNA和反义bcl-2核苷酸片段，终浓度为100μmol^．L^-1；再培养24 h时又加入反义核酸1次，继续培养共48 h. 制成单个细胞悬液，按常规做流式细胞仪测定.

2结果

2.1反义寡核苷酸对RPE的PCNA和bcl-2表达的影响反义PCNA作用48 h后，RPE的PCNA染色减弱. 细胞图像分析显示对照组的细胞积分A值为28±4，处理组的为20±1下降29%(P＜0.05).反义bcl-2作用48 h后，bcl-2染色强度无明显改变，图像分析结果对照组的积分A为83±4，处理组为80±2(P＞0.05).

2.2MTT比色法检测反义PCNA对RPE增生的作用A值在细胞数为1×10³～1.5×10⁴个范围内呈线性相关(r=0.98，P＜0.05).反义PCNA作用后的不同时间内，各浓度组的A值逐渐下降.从低到高5种浓度(6.25,12.5,25,50和100 μmol^．L^-1)的反义PCNA对RPE生长的抑制率，在2 d时依次分别为8.3％,13.6％,20.6％,23.3%和28.8%；3 d时，抑制率依次分别为12.1%,18.1％,24.5％,27.5％和34.4％；4 d时的抑制率依次分别为17.1％,24.5％,30.3％,33.3％和38.4％.抑制作用呈浓度依赖性(P＜0.05).无关对照序列对细胞生长无抑制作用. 100 μmol^．L^-1的反义PCNA作用4 d时，细胞生长较慢，细胞密度较对照组密度明显减少，而细胞形态未见明显影响，无细胞脱离.台盼蓝染色显示处理组与对照组的细胞存活率均达94％，表明对细胞无明显毒性.

2.3反义核苷酸片段对细胞周期的作用流式细胞仪测定分析结果,100 μmol^．L^-1浓度的反义PCNA作用于细胞48 h后，RPE的G1期细胞增加了10%，S期细胞减少40%，S+G2+M期细胞减少24%.反义bcl-2作用后细胞周期无明显改变.

3讨论

反义寡聚脱氧核苷酸具有与靶基因的mRNA互补的序列，可调控细胞的增生和细胞表型,是反义核酸技术中最简单有效的方法^［4］.我们选择了mRNA的启动子部位作为反义PCNA和反义bcl-2片段的作用部位^［8］，前者的长度为18 mer，后者为15 mer，这样既可有效作用，也可减少因片段过长引起非特异性杂交作用^［4］. pCNA是一种有丝分裂信号中的最终通路的细胞内因子.它是正常的和肿瘤细胞的DNA复制的关键.我们假设用反义核酸下调PCNA的表达可能有助于抑制RPE的增生.文献中尚未见对RPE生长作用的报告.

检测靶基因在细胞中的表达状态，是判断反义核酸效果的重要指标.实验表明，2 d时经反义PCNA作用的RPE的PCNA表达呈有意义地下降，图像分析测定值减少了近30%，这表明细胞的PCNA合成受到抑制.因为缺乏可比性, 这一数值的意义尚难判定. 不过，培养的人RPE细胞在生长中是非同步化的细胞，我们测定的PCNA蛋白表达率在传代培养12～48 h最高为50%，这与Celis等^［9］报告的未经同步化处理的羊膜细胞的PCNA表达阳性率为42%相似.因此可以推测，即使是有效的抑制，反义核酸作用后的蛋白表达率也不会高于这一数值，近30%的下调可以认为是有效的抑制了PCNA的表达.

实验结果还表明，反义PCNA可抑制RPE生长，在6.25 μmol^．L^-1浓度，作用3 d即可抑制细胞的增生，这种抑制作用随反义片段的浓度加大而增强，呈剂量依赖性.细胞周期也发生变化，S期DNA含量下降，G1期增加.细胞周期的改变与Jaskulski等^［8］的报告一致. 他用18 mer的反义PCNA抑制经同步化处理的、鼠3T3细胞的生长，抑制率达47％；S期DNA含量降低，表明PCNA反义寡核苷酸的阻断作用发生在G1/S交界区或S早期.我们的结果显示，反义PCNA对RPE增生的最大抑制率为38.8%.反义核酸对细胞生长的抑制率与细胞是否同步化及生长活性等有关，对同步化细胞和肿瘤细胞的抑制率通常会较高些^［8］. rPE为非同步化细胞，PCNA蛋白表达率最高为50%左右，细胞周期分析显示RPE的S期DNA含量为28.3％. rPE不是肿瘤细胞，只是可以恢复生长活性的一种非终末细胞,在实验条件下用单一血清培养时，RPE的增殖速率和DNA合成水平较低，因此反义核酸对其的抑制是有限的.但在临床作为手术后或防治PVR的一种辅助方法，有进一步研究的价值.

本实验没有显示反义核酸片段对RPE的bcl-2表达和细胞生长有明显作用,也未观察到对RPE的凋亡诱导作用. 我们推测，bcl-2在培养的RPE处于低水平表达^［5］等因素与此有关.

基金项目：国家自然科学基金资助项目(39470742)

作者简介：王琳(1965-)，女(汉族)，山东省蓬莱县人.博士，讲师，主治医师. 发表论文20篇. Tel.(029)3373480王琳（第四军医大学西京医院眼科）惠延年（第四军医大学西京医院眼科)

王雨生（第四军医大学西京医院眼科)

惠宏襄（基础部生物化学教研室，陕西 西安 710033)

金明（基础部生物化学教研室，陕西 西安 710033）

参考文献:

［1］ Hui YN, liang HC, Cai YS et al. Corticosteroid and daunomycin in the prevention of experimental proliferative vitreoretinopathy induced by macrophages［J］. graefe's Arch Clin Exp Ophthalmol, 1993;231(2):109-114.

［2］ 惠延年,梁厚成,胡丹et al.玻璃体手术与地塞米松眼内灌注治疗增殖性玻璃体视网膜病变［J］.第四军医大学学报,1996;17(5):387-388.

［3］ Campochiaro PA. Pathogenic mechanisms<