第三军医大学学报2000年第22卷第7期

杨金亮房殿春杨仕明罗元辉罗昆仑鲁荣刘为纹

摘要： 目的探讨反义hTR基因转染对胃癌细胞系SGC-7901恶性表型的逆转作用及其在肿瘤基因治疗中的价值。方法构建包含端粒重复序列模板区的反义hTR基因真核表达载体，用脂质体法将其转染至胃癌细胞系SGC-7901，比较观察反义hTR基因转染后7901细胞的hTR rNA表达、端粒酶活性、体外生长增殖特性和裸鼠体内致瘤能力的变化。结果反义hTR基因转染的7901细胞hTR rNA表达和端粒酶活性明显降低、体外生长增殖能力降低、接触抑制恢复、细胞凋亡率增加、软琼脂集落形成能力和裸鼠体内致瘤能力完全消失。结论反义hTR基因转染能使7901细胞的端粒酶活性明显下调并逆转其恶性表型，提示端粒酶是肿瘤治疗的较理想靶点，端粒酶抑制剂具有良好的临床应用前景。

关键词：人端粒酶RNA组份(hTR)；端粒酶；真核表达载体；基因治疗；反义基因；胃癌细胞系

端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白质构成的一种特殊的逆转录酶，能催化合成染色体末端的端粒DNA重复序列，以维持染色体的稳定和完整^［1］。1995年，Feng等^［2］最先克隆了人端粒酶RNA组份(Human telomerase RNA components, hTR)的基因并证明了反义hTR能下调人宫颈Hela癌细胞的端粒酶活性，导致端粒进行性缩短，经23～26个倍增周期后，细胞增殖停止并死亡。这一研究为人们提供了干预端粒酶活性治疗肿瘤的新思路。胃癌组织的端粒酶阳性率高达90%，且与肿瘤恶性程度和预后密切相关^［3，4］。为此，我们构建了反义hTR真核表达载体，将其转染至SGC-7901胃癌细胞，探讨了反义hTR对SGC-7901胃癌细胞恶性生物学行为的影响。

1材料与方法

1.1载体构建包含成熟hTR cDNA的pGRN83克隆载体由美国Geron公司惠赠，真核表达载体pCL-neo购自Promega。用MluⅠ和SalⅠ限制性内切酶从pGRN83上切长约579 bp的hTR片段，反向插入pCL-neo表达载体，将连接产物转化JM109大肠杆菌(氯化钙法)，少量提取质粒酶切鉴定，并经测序确认。

1.2细胞培养

SGC-7901细胞培养于含10%灭活的小牛血清、100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素的RPMI1640培养液中，培养条件为37℃、5%CO₂、饱和湿度，每隔2～3d用0.25%胰酶/0.02%EDTA消化，以1∶3～1∶5传代1次。

1.3基因转染采用DOTAP脂质体(BoehringerMannheim),转染过程按试剂说明书进行。转染后48h将细胞以1∶5传代，加G418400μg/ml进行筛选，约2周左右抗性细胞克隆形成，在200μg/mlG418的选择压力下进行扩大培养，并冻存保种。反义hTR基因转染的7901细胞命名为7901-ahTR，空载体pCL-neo转染的7901细胞命名为7901-neo。

1.4RT-PCR法鉴定转基因细胞的hTRRNA表达RNA提取用Tripure试剂(Boehringermannheim)按说明书进行。RT-PCR采用一步一管法(AcessRT-PCRsystem,Promega)。hTR引物为P1：5′-TCTAACCCTAACTGAGAAGGGCGTAG-3′；P2：5′-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3′，扩增片段长度为126bp。扩增正义hTR时先加上游引物P1，反转录后再加下游引物P2进行PCR扩增；扩增反义hTR时先加下游引物P2，反转录后再加上游引物P1进行PCR扩增。GAPDH引物(作为外参照)为P1：5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′，P2：5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCAC-3′，扩增片段长度为598bp。反应体系为：总体积25μl、dNTP0.2mmol/L,上下游引物各1mmol/L、MgSO₄1mmol/L、AMV逆转录酶0.1U/ml、TflDNA聚合酶0.1U/ml、1×反应缓冲液、RNA模板100ng、扩增条件为48℃，45min→94℃，2min→94℃，30s；60℃，40s；68℃，1min;40cycles→68℃，7min。取3～6μl扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并拍照。

1.5端粒酶活性测定采用TelomerasePCR-ELISA半定量法(试剂盒购自Boehringermannheim)，按说明书标准程序进行。

1.6细胞形态学观察倒置显微镜下常规和HE染色比较观察SGC-7901细胞和反义hTR转染的SGC-7901细胞在大小、形态及生长方式上的差别。

1.7细胞生长增殖能力测定用MTT法测定细胞增殖能力。

1.8细胞周期和细胞凋亡测定收集对数生长期细胞，PBS漂洗后，70%冷乙醇固定24h以上，碘丙啶(PI)染色，采用流式细胞仪(FACS420)检测细胞各期的分布和细胞凋亡率。

1.9软琼脂集落形成实验参照文献［5］进行。

1.10裸鼠致瘤能力观察4周龄Balb/c裸鼠，雌性，分3组(3只/组)，分别于左右侧背部皮下注射1.5×10⁶个SGC-7901和7901-neo细胞、1.5×10⁶个SGC-7901和7901-ahTR细胞、3×10⁶和1×10⁷个7901-ahTR细胞，观察肿瘤出现时间、生长速度、肿瘤大小及小鼠存活期。

2结果

2.1hTR反义真核表达载体(pCL-ahTR)的构建和鉴定用MluⅠ和SalⅠ从pGRN83上切下长约579bp的hTRcDNA片段，定向连入pCL-neo载体的XhoⅠ/MluⅠ酶切位点上(XhoⅠ与SalⅠ酶切后的末端为匹配粘性末端)，将连接产物转化大肠杆菌，抽提质粒，经PstⅠ、HindⅢ等酶切鉴定、所得片段与理论设计值完全符合，测序结果同报道的hTRcDNA序列一致，见图1。

图1质粒pGRN83和pCL-ahTR酶切鉴定图谱

fig 1Restriction endonuclease map of pGRN83 and pCL-ahTR

1：pGRN83/MluⅠ and salⅠ digested(3.0 kb+0.58 kb)；2：λDNA/HindⅢ marker；3：pCL-ahTR/PstⅠ digested(3.67 kb+2.38 kb)；4：pCL-neo/PstⅠdigested(3.67 kb+1.81 kb)

2.27901-ahTR细胞反义hTR RNA的表达和hTR RNA表达水平的变化

7901-ahTR细胞有反义hTR RNA的表达，其正义hTR RNA表达水平较未转染细胞和转染对照质粒pCL-neo的细胞明显降低，见图2。

图2hTR RT-PCR结果

fig 2Results of hTR RT-PCR

1：7901-ahTR cells/hTR RNA；2：7901-ahTR cells/antisense hTR RNA；3：7901-neo cells/hTR RNA；4：7901 cells/hTR RNA；5：PCR marker

2.3反义hTR基因转染对7901细胞端粒酶活性的影响

反义hTR基因转染的7901细胞端粒酶活性明显下调，较父系7901细胞和空载体转染7901细胞的端粒酶活性下调了约2/3，见图3。

图37901-ahTR和7901细胞的端粒酶活性比较

fig 3Comparison of telomerase activity in 7901-ahTRcells and parent 7901 cells

2.4反义hTR基因转染对7901细胞体外生长增殖特性的影响

反义hTR基因转染的7901细胞体积略有增大、呈圆形或梭形、轮廓清楚、核浆比例减少、瘤巨细胞减少、异形性降低，且7901-ahTR细胞只能呈单层生长，在长至100%汇合后恢复接触抑制和密度抑制，此后细胞分裂增殖速度显著降低，细胞容易脱壁、老化甚至死亡；而相应7901细胞和转染对照质粒pCL-neo的细胞大小形状不一、核深染不规则、瘤巨细胞较多，能叠加甚至悬浮成团生长，丧失了接触抑制和密度抑制的特性。

2.5反义hTR基因转染对7901细胞体外增殖能力的影响

7901-ahTR细胞较7901和7901-neo细胞的生长速度明显减慢，尤其是在达到对数生长期后，见图4。

图47901和7901-ahTR细胞体外增殖能力比较

fig 4Comparison of cellular proliferation capacity of

7901-ahTR cells and parent 7901 cells in vitro

2.6反义hTR基因转染对7901细胞软琼脂克隆形成能力的影响

亲本7901细胞和7901-neo细胞均能在软琼脂固体培养基中形成较大的集落，其集落形成率分别为10%和8.5%，而反义hTR基因转染的7901细胞在软琼脂培养基上不能形成克隆，说明反义hTR基因转染使7901克隆形成能力降低或丧失。

2.7反义hTR基因转染对7901细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响

反义hTR基因转染的7901细胞和亲本及空载体转染的7901细胞相比，G₀/G₁期细胞从59.0%和60.2%上升至70.7%，S期细胞从18.2%和17.5%下降至12.0%，G₂/M期