第二军医大学学报2000年第21卷第4期

陈志辉管惟滨吴少廷缪为民焦炳华

摘要目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2全基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用PCR扩增恶性疟原虫FCC-1/HN株MSP2基因，克隆插入pUC19，并重组入表达质粒载体中，转化大肠杆菌，诱导重组质粒pBK-CMV/msp2表达MSP2蛋白，对表达产物进行SDS-PAGE，dot-ELISA和Western blot鉴定。结果：PCR扩增出824 bp DNA片段，经酶切鉴定和部分序列测定证实为MSP2基因序列；表达产物的相对分子质量为3.2×10⁴，与MSP2的理论分子质量相符，用dot-ELISA和Western blot均证实表达产物具有恶性疟原虫抗原表位。但表达产物的量较低，约占菌体总蛋白量的10%。结论：恶性疟原虫MSP2基因可以在大肠杆菌中得到表达，但表达产物的产量有待进一步提高。

关键词：疟原虫，恶性；裂殖子表面蛋白2；基因克隆；原核表达

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2 （merozoite surface protein-2，MSP2）是恶性疟原虫红细胞期重要的保护性抗原之一，MSP2分子位于裂殖子表面，抗MSP2的单克隆抗体和免疫血清在体外能有效地阻断裂殖子侵入红细胞和抑制疟原虫生长^［1,2］，用恶性疟原虫MSP2免疫小鼠能保护小鼠抵抗夏氏疟原虫感染^［3,4］。为了进一步研究MSP2及其基因的免疫学特性及生物学特点，我们克隆出恶性疟原虫FCC-1/HN株MSP2全基因，并且在大肠杆菌内得到了表达。

1材料和方法

1.1主要材料和试剂恶性疟原虫FCC-1/HN株由广东药学院惠赠，深圳市卫生防疫站体外培养冻存。DNA合成全套试剂为美国ABI公司产品，Taq dNA 聚合酶、限制性内切酶和T4 DNA 连接酶均为Promega公司产品。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)均为Serva公司产品。HRP标记羊抗人IgG抗体为华顺生物试剂公司进口美国产品分装。

1.2方法

1.2.1恶性疟原虫MSP2基因的扩增及初步酶切鉴定采用PCR方法扩增MSP2基因序列，根据恶性疟原虫MSP2基因序列借助PCGENE和GOLDKEY核酸蛋白质计算机分析软件（瑞士；中国人民解放军军事医学科学院）自行设计并合成一对引物，P1：5′- CTCGTCGACTGTCAAAATGAAGGTAA-3′,P2： 5′- cAGGATCCGAGAATTATATGAATATGGCA-3′，在391-05型DNA/RNA合成仪（美国PE公司)上合成，采用OPC柱纯化。提取恶性疟原虫基因组DNA作为PCR反应的模板，在9600型PCR扩增仪( pE公司)上反应，基本反应程序，95℃预变性2 min,94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min,循环30次。取PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后置凝胶分析系统中观察，拍照记录。PCR产物采用Wizard pCR Preps DNA纯化系统试剂盒纯化，取纯化产物用限制性内切酶XbaⅠ酶切，酶切产物作3%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定。

1.2.2MSP2基因的克隆及重组质粒的鉴定取经纯化的PCR MSP2基因产物和质粒pUC19，分别用SalⅠ和BamHⅠ双酶切，酶切产物经纯化，T4 dNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌JM103，平板培养转化菌，挑取白色菌落，液体培养，小量制备质粒，用限制性内切酶酶切鉴定。采用Abi prism377型DNA测序仪，应用M13正向通用引物对克隆的MSP2基因进行序列测定（美国Cybersyn公司）。重组质粒命名为pUC19/msp2。

1.2.3MSP2全基因在大肠杆菌中的表达重组表达质粒pBK-CMV/msp2的构建，取质粒pUC19/ msp2用Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ 双酶切回收MSP2，与经相应酶切的表达载体pBK-CMV（STRATA-GENE公司，美国）连接，常规筛选重组子，并采用PCR和酶切鉴定。重组质粒在大肠杆菌中的表达，取经鉴定的重组表达质粒pBK-CMV/msp2和载体质粒pBK-CMV转化的大肠杆菌DH5α，分别接种含100μg/ml卡那霉素的LB细菌培养液3 ml，37℃振荡培养过夜。取40 μl菌液接种含100μg/ml卡那霉素的LB细菌培养基4 ml，37℃振荡培养4 h，加IPTG使终浓度为1 mmol/L，继续37℃振荡培养4 h。表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。表达蛋白按文献方法进行Western blot鉴定^［5］，恶性疟患者血清工作浓度为1∶100，酶标羊抗人IgG工作浓度为1∶1000。

2结果

2.1恶性疟原虫MSP2基因的扩增及酶切鉴定采用PCR方法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出824 bp的片段（图1)；PCR产物用XbaⅠ酶切得到632和192 bp两个片段（图2)，均与理论值大小一致。

图 1PCR扩增恶性疟原虫基因组中的MSP2基因

fig 1MSP2 gene amplified by PCR from genomic

dNA of P.falciparum

lane 1：Molecular mass marker (pBR322/BstN I);

lane 2：P.falciparum FCC-1/HN

图 2MSP2基因PCR扩增产物XbaⅠ酶切鉴定

fig 2Identification of MSP2 gene by Xba Ⅰ digestion

lane 1：Molecular mass marker(pBR322/Msp I)；

lane 2：MSP2 gene digested with Xba Ⅰ

2.2重组克隆质粒的构建及鉴定MSP2基因重组克隆质粒pUC19/msp2的大小为3 487 bp，采用MSP2基因两端引物，质粒作为模板进行PCR扩增，得到与插入片段大小一致（824 bp）的DNA；质粒用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，得到与质粒载体和插入基因片段大小一致的两段DNA。

2.3克隆MSP2基因的序列测定3′端部分(第296～795位碱基)序列的测定结果通过GOLDKEY核酸蛋白质分析软件比较分析，其序列与国内李明等^［6］的测序结果一致。

2.4MSP2基因在大肠杆菌中表达产物的SDS-PAGE分析及Western blot鉴定质粒pBK-CMV/msp2在大肠杆菌DH5α中的表达产物经SDS-PAGE分析，与载体质粒转化菌比较，含MSP2基因转化菌电泳凝胶上出现新的蛋白条带，为相对分子质量约3.2×10⁴的蛋白（图3），加IPTG诱导4 h表达量最高，该条带所含蛋白量约占菌体蛋白总量的10%。将质粒转化菌菌体蛋白转移到混合纤维素滤膜上，用恶性疟原虫患者血清进行Westernblot分析，在相当于3.2×10⁴处出现与患者血清反应的特异染色区带，而不带MSP2基因的载体转化菌未见特异染色带（图4）。

图 3质粒pBK-CMV/msp2表达产物的SDS-PAGE分析

fig 3SDS-PAGE analysis of the proteins expressed

by E.coli bearing pBK-CMV/msp2

lane 1： Molecular mass marker； Lane 2： pBK-CMV/DH5α after induction with1 mmol/L IPTG； Lane 3,4： pBK-CMV/msp2/DH5α

expressing MSP2 after induction for 3 or 4 h

with 1 mmol/L IPTG,respectively

图 4pBK-CMV/msp2表达产物的Western blot鉴定

fig 4Expressed product of pBK-CMV/msp2 was

identified by Western blotLane 1：Molecular mass marker； Lane 2：pBK-CMV/DH5α after

induction with 1 mmol/L IPTG； Lane 3：pBK-CMV/msp2/DH5α

expressing MSP2 afterinduction with 1 mmol/L IPTG；

lane 4：pBK-CMV/msp2/DH5α expressing MSP2

reacted with normal serum

3讨论

MSP2是恶性疟原虫红细胞期重要的保护性抗原之一，相对分子质量3.5×10⁴～5.5×10^4［7］，但是其基因编码序列的全长为795 bp，编码264个氨基酸 ^［8］。根据恶性疟原虫不同地理分离株MSP2基因序列的分析表明，MSP2具有两种不同的等位基因型，不同虫株基因序列和抗原表位有较大差异^{［6，8～10}］，我国虫株（包括FCC-1/HN与FC-27株）高度同源^［6］。

过去对MSP2基因的多态性研究较多，但对它作为疫苗候选物的研究还不够深入，恶性疟原虫完整MSP2基因体外表达国内尚未见报道。本研究根据基因库中恶性疟原虫FC-27株的MSP2基因序列设计引物，从我国FCC-1/HN株恶性疟原虫基因组中扩增出大小约824 bp的DNA产物，经限制性内切酶片段分析及对克隆质粒MSP2基因3′端部分序列测定结果与国内报道的序列一致，表明所得到的克隆质粒含恶性疟原虫MSP2基因序列。克隆的基因进一步重组插入质粒pBK-CMV，在大肠杆菌内<