第四军医大学学报2000年第21卷第2期

安华章黄文林陈峥刘志国樊代明

摘要: 目的构建p53重组腺病毒载体以研究p53过度表达与腺病毒感染对细胞生长的影响.方法将p53 cDNA克隆到转移载体pAdCMV/p53重组质粒,用该重组质粒及pJM17质粒共转染293细胞获得重组腺病毒，PCR法筛选含p53 cDNA的重组病毒.结果在挑选的5个空斑中，有4个含p53 cDNA阳性重组腺病毒. p53重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞内进行有效的复制.结论成功构建了p53重组腺病毒, 为进一步研究p53重组腺病毒的功能提供了条件.

关键词：腺病毒,人；表达载体；p53

0引言

重组腺病毒作为有效的载体近年来越来越多地被用于基因治疗的研究.腺病毒感染细胞后可抑制宿主细胞的蛋白合成并影响细胞的生长.而p53蛋白则是重要的细胞生长周期调控因子. 我们构建了p53重组腺病毒，以了解p53蛋白过度表达与腺病毒感染对细胞生长的协同抑制作用.

1材料和方法

1.1材料腺病毒载体系统pAdCMV-Linker，pJM17及293细胞,培养基为含100mL^．L^-1 fBS的高糖DMEM. 培养条件为37℃,50 mL^．L^-1 cO₂, pSP73质粒、pC53-CN3（含1.8 kb的全长p53 cDNA）由普林斯顿大学惠赠.限制性内切酶、T₄DNA连接酶、高糖DMEM、胎牛血清购自Gibco公司，Takara lA Taq购自Takara Shuzo Co Ltd. 琼脂粉购自Difcol公司.

1.2方法质粒DNA的克隆按标准步骤^［1］进行.用EcoRⅠ酶切pC53-C1N3，10 g^．L^-1琼脂糖凝胶电泳回收1.8 kb片段，将该片段克隆在pSP73质粒的EcoRⅠ位点，分别用EcoRⅠ,PvuⅡ,SmaⅠ酶切重组pSP73/p53质粒以鉴定插入片段的大小及方向. 选择插入的p53 cDNA的方向与SP6启动子转录方向一致的重组质粒，用ClaⅠ,KpnⅠ双酶切，回收1.8 kb DNA片段并克隆在pAdCMV-Linker质粒上的ClaⅠ,KpnⅠ位点，用EcoRⅠ,SmaⅠ酶切鉴定重组质粒pAdCMV/53插入片段的大小及方向.脂质体Tfx^TM-20介导法将pAdCMV/p53及pJM17质粒共转染293单层细胞（转染操作按Promega操作手册进行），空斑抽提物PCR法^［2］筛选重组病毒.每个60 mm培养皿加入pAdCMV/p53 5 μg, pJM17质粒5 μg进行共转染. 20 h后加入含有10 mmol^．L^-1 MgCl₂,40 mL^．L^-1小牛血清、75 g^．L^-1 naHCO₃和10 g^．L^-1琼脂糖DMEM复盖转染的293细胞.14 d后挑选5个空斑，分别悬于1 mL 1 mmol^．L^-1 eDTA,0.01 mol^．L^-1 NaCl,0.01 mol^．L^-1 tris. HCl(pH 7.9)，反复冻融3次，每种悬液吸取500 μL，加100 g^．L^-1 sDS 35 μL,0.5 mol^．L^-1 EDTA 13 μL, 20 g^．L^-1蛋白酶K,35 μL, 37℃水浴4 h，酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，PCR法筛选空斑溶解物. pCR所用5′引物与p53 cDNA -47～-018位碱基互补. 3′引物与病毒基因组的第3630～3674个碱基互补.琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物，根据PCR扩增产物特有的片段长短筛选p53 cDNA阳性的重组病毒形成的空斑. 通过传代293细胞扩增阳性空斑内的病毒，并进行第2次空斑纯化和筛选.

2结果

2.1转移质粒的构建EcoRⅠ酶切重组体pSP73/53可得到大小分别为2.46，1.8 kb的两个片段，2.46 kb的片段为线性化pSP73质粒DNA，1.8 kb片段为p53 cDNA. p53 cDNA 518位、1409位分别有一个PvuⅡ,SmaⅠ位点.含有插入方向正确的p53 cDNA的重组pSP73/p53,经PvuⅡ酶切产生大小分别为3.0 kb，0.9 kb的两个片段,经SmaⅠ酶切产生大小分别为3.5 kb，0.4 kb的两个片段（Fig1）. pAdCMV-Linker质粒KpnⅠ位点下游0.9 kb处有SmaⅠ酶切位点，因此pADCMV/p53经SmaⅠ酶切可产生1.2 kb大小的片段（Fig2）.

图 1pSP73/p53重组质粒酶切鉴定结果

fig 1Identification of pSP73/p53 digested with restriction enzymes

lane A: 1 kb marker. Lane B: pSP73/p53 plasmids. Lane

c: pSP73/p53 was digested by EcoRⅠand a 1.8 kb fragment was inserted

at EcoRⅠ site. Lane D: the 1.4 kb fragment between the PvuII sites

in the inserted p53 cDNA and pSP73 pasmid. Lane E: the 0.4 kb fragment

between the SmaI sites in p53 cDNA and pSP73 plasmid.

图 2PAdCMV/p53重组质粒酶切鉴定结果

fig 2Identification of pAdCMV/p53 digested with restriction enzymes

lane A: 1 kb marker; Lane B: pAdCMV-linker; Lane C: pAdCMV/p53;

lane D and F: pAdCMV-linker digested with EcoRⅠ and SmaI correspondingly;

lane E: pAdCMV/p53 digested with EcoRⅠ, the 1.8 kb fragment is the inserted p53

cDNA; Lane G: pAdCMV/p53 digested with SmaⅠ, a 1.2 kb fragment could be found.

2.2重组腺病毒的筛选转染后7 d即可观察到空斑的产生，但该空斑抽提物经PCR扩增未产生特定大小的DNA片段.转染后14 d挑选5个空斑进行筛选，经PCR扩增其中4个空斑的提取物产生了大小为2.1 kb的DNA片段（Fig 3）. 用p53 cDNA阳性空斑冻融悬液感染293细胞，5 d后均可观察到细胞肿胀、变圆及蚀斑的出现.

图 3p53重组腺病毒的筛选

fig 3Screening for p53 recombinant adenoviruses

lane A: 1 kb marker; Lane B: pAdCMV/p53; Lane C: 293 cells

extraction; Lane D～H: adenovirus plaques. The 2.1 kb PCR products

can be found in lane B, D, E, F and G, but not found in lane C and H.

3讨论

pAdCMV-Linker含有Ⅴ型腺病毒基因左侧的0～16图距单位.其E1A编码区缺失，并在缺失区插入CMV、多克隆位点、Poly A合成区等. pAdCMV/53与pJM17在包装细胞293细胞内同源重组从而产生大小在腺病毒有效包装范围内的重组体腺病毒DNA.该重组体E1A编码区缺失，不具有自我复制能力，但E1A转化的胚肾细胞293细胞可产生E1A蛋白，反式作用于重组体DNA，从而使重组体得到有效的复制并包装成具有感染性的缺陷型腺病毒^［3］. pJM17为腺病毒基因组DNA在3.7图距单位处插入4.3 kb的外源片段而形成的质粒，大小为40.3 kb，超出腺病毒包装范围从而能显著降低野生型病毒的产生^［4］.

在本实验中，转染后1 wk即出现空斑，而PCR扩增未产生特定大小的DNA片段，提示不含有目的基因的重组体生长较快，并可能是由于pJM17自身重排而产生的.

在早期的研究中，腺病毒载体系统共转染293细胞大多采用磷酸钙沉淀法^［2,4］.我们利用脂质体作为转染介质，亦得到满意的结果，说明该方法可有效地用于腺病毒DNA的转染.重组体的筛选可利用限制性酶切、PCR,Southern blot,Western blot等方法进行.利用PCR方法进行筛选，可在最短的时间内筛选出含有目的基因的重组体.但由于在DNA重组过程中可产生不同结构的重组病毒，来自不同空斑的重组体其目的基因的表达水平可存在很大差异.要想获得目的基因表达水平较高的重组体，尚需利用Western blot，Motility shift assay等功能性检测方法进行进一步的筛选.

基金项目:国家自然科学基金国际合作基金腺病毒载体专项基金资助作者简介:安华章(1968-)，男(汉族),安徽省霍邱县人.硕士，1997年第四军医大学博士生(导师樊代明). Tel.（029）3375229; fax.（029）2539041Email. ahzlsl@freemail.263.

安华章（第四军医大学西京医院消化病研究所,陕西 西安 710033）黄文林（美国普林斯顿大学分子生物学系）陈峥（第四军医大学西京医院消化病研究所, 陕西 西安 710033）刘志国（第四军医大学西京医院消化病研究所, 陕西 西安710033）樊代明（第四军医大学西京医院消化病研究所, 陕西 西安710033）

参考文献:

［1］萨姆布鲁克 J，弗里奇 EF，曼<